Информације

Која је разлика између понашања протеина и ДНК током електрофорезе у агарозном гелу?

Која је разлика између понашања протеина и ДНК током електрофорезе у агарозном гелу?



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Планирам научни пројекат о гел електрофорези, и волео бих да знам да ли их има мерљив, мерљив (на пример, ствари које бих могао да представим у графикону или графикону) разлике између понашања протеина и ДНК током електрофорезе у агарозном гелу. Детаљни улази и корисни линкови су веома цењени.


Постоје две важне особине које одређују како ће се молекул кретати током гел електрофорезе:

  • величина и облик молекула
  • наелектрисање молекула

Примењујете електрично поље и сви молекули ће се кретати у складу са својим наелектрисањем. Сам гел омета кретање већих молекула. То значи да ће се мали молекули кретати даље од великих молекула.

Нуклеинске киселине попут РНК и ДНК имају уједначен негативни набој из фосфатне кичме. То значи да ће се они генерално одвојити према својој величини и облику (плазмиди могу бити присутни у различитим облицима као што су суперзамотани, кружни или линеаризовани).

Протеини имају различита наелектрисања, неки имају позитивно наелектрисање при пХ који се обично користи за гел електрофорезу, неки имају негативан набој, а неки немају наелектрисање при том пХ. Дакле, ако бисте једноставно ставили протеине на гел, неки би се кретали уназад, неки напред, а неки никако.

Да би се протеини раздвојили према њиховој величини, користимо детерџент СДС за денатурацију протеина и да им дамо једнолично наелектрисање (СДС је негативно наелектрисан). Протеини се такође користе на полиакриламидним геловима, а не на агарози, јер величина пора у агарози не одговара типичној величини протеина.

Иако никада нисам видео да неко користи агарозу за протеине, чини се да је то могуће и понекад се користи за веће протеине. Нашао сам један рад који описује протокол, користили су врло високе концентрације агарозе у распону од 4-5%. Претпостављам да се неће добро носити, али то би требало да испробате сами. Ако су протеини које испитујете мало већи, употреба агарозе би требало да буде могућа.


Разлика између СДС ПАГЕ и гел електрофорезе

Електрофореза се може користити за утврђивање масе објекта обично за протеине и деоксирибонуклеинску киселину (ДНК). Ланац ДНК, када се упозна са хемикалијама, може убрзати или успорити процес информисања. ДНК маркери познате масе се користе за апроксимацију величине објеката који путују када се електрофореза заврши. Електрофореза ће највероватније бити најчешће коришћени алат за молекуларне биологе и биохемичаре.

Постоје две врсте електрофорезе које се обично користе у овом процесу. То су електрофореза на натријум додецил сулфату у полиакриламидном гелу (СДС-ПАГЕ) и електрофореза у природном гелу.

СДС-ПАГЕ је неселективна метода гел електрофорезе која се користи у областима као што су: биохемија, форензика, биологија и генетика за одвајање протеина од њихове електрофоретске покретљивости. СДС је ањонски сурфактант који се може користити за помоћ у лизирању ћелија током екстракције ДНК и за одвајање протеина у СДС-ПАГЕ. Током електрофорезе, мешавина протеина се прво утекује у раствор СДС. Затим се примењује супстанца која се зове Мерцаптоетанол да би се уклониле дисулфидне везе како би се протеин учинио линеарним. Затим се покреће електрофореза. Резултати би дали два остатка молекула, од којих је један СДС-ПАГЕ.

Одсуство СДС-ПАГЕ није проблем јер се гел електрофореза и даље може урадити само да протеини не изгубе сву своју секундарну и терцијарну структуру и да се не отворе у генерално праве штапиће.

У међувремену, нативна гел електрофореза користи гел као антиконвективни медијум. Обично се користи за одвајање биолошких макромолекула као што су ДНК, рибонуклеинска киселина (РНА) и протеин. Такође се може користити за одвајање наночестица.

Постоје два главна гела који се користе у нативној гел електрофорези, и то:

Агарозни гел који се користи за веће молекуле. Овај гел не идентификује мале разлике између две молекуларне траке. Такође се користи искључиво за одвајање ДНК. Визуелизација агарозног гела се врши мешавином етидијум бромида.

Полиакриламидни гел који се користи за мање молекуле. Овај гел идентификује разлике између молекуларних трака. Осим ДНК, може да одвоји и протеине.

1.СДС-ПАГЕ је неселективна метода гел електрофорезе која се користи у областима као што су: биохемија, форензика, биологија и генетика за одвајање протеина од њихове електрофоретске покретљивости док се гел електрофореза обично користи за одвајање биолошких макромолекула као што је ДНК, рибонуклеинска киселина (РНА) и протеин. Такође се може користити за одвајање наночестица.

2.Нативна гел електрофореза има два типа, и то: агарозни гел и полиакриламидни гел.


Електрофореза у агарозном гелу за одвајање фрагмената ДНК

Електрофореза у агарозном гелу је најефикаснији начин одвајања фрагмената ДНК различитих величина у распону од 100 бп до 25 кб(1). Агароза је изолована из родова морских алги Гелидиум и Грацилариа и састоји се од поновљених подјединица агаробиозе (Л- и Д-галактозе)(2). Током гелирања, полимери агарозе се нековалентно повезују и формирају мрежу снопова чије величине пора одређују својства молекулског просејавања гела. Употреба електрофорезе у агарозном гелу револуционирала је одвајање ДНК. Пре усвајања агарозних гелова, ДНК је примарно одвојена центрифугирањем са градијентом густине сахарозе, што је само дало приближну величину. Да би се одвојила ДНК помоћу електрофорезе у агарозном гелу, ДНК се убацује у претходно изливене удубине у гелу и примењује струја. Фосфатна кичма молекула ДНК (и РНК) је негативно наелектрисана, тако да када се ставе у електрично поље, фрагменти ДНК ће мигрирати на позитивно наелектрисану аноду. Пошто ДНК има уједначен однос маса/наелектрисање, молекули ДНК су раздвојени по величини унутар агарозног гела на такав начин да је пређено растојање обрнуто пропорционално лог његове молекулске тежине(3). Водећи модел за кретање ДНК кроз агарозни гел је "пристрасна репптација", при чему се предња ивица помера напред и вуче остатак молекула дуж (4). Брзина миграције молекула ДНК кроз гел одређена је следећим: 1) величином молекула ДНК 2) концентрацијом агарозе 3) конформацијом ДНК (5) 4) примењеним напоном, 5) присуством етидијум бромида, 6) врстом агарозе и 7) пуфера за електрофорезу. Након одвајања, молекули ДНК се могу визуализовати под УВ светлом након бојења одговарајућом бојом. Пратећи овај протокол, ученици треба да буду у стању да: схвате механизам којим се фрагменти ДНК одвајају унутар гела матрикса Разуме како ће конформација молекула ДНК одредити његову мобилност кроз гел матрикс Идентификовати раствор агарозе одговарајуће концентрације за њихове потребе Припремити агарозни гел за електрофорезу узорака ДНК Поставите апарат за електрофорезу у гелу и напајање Одабери одговарајући напон за одвајање фрагмената ДНК Разуме механизам помоћу којег етидијум бромид омогућава визуелизацију ДНК трака Одредите величине раздвојених ДНК фрагмената.


Како кружна плазмидна ДНК ради током гел електрофорезе?

Услови гел електрофорезе (укључујући присуство етидијум бромида, концентрације гела, јачину електричног поља, температуру и јонску снагу пуфера за електрофорезу) могу утицати на покретљивост плазмидне ДНК. Због мреже агарозног гела, кружна плазмидна ДНК се лакше хвата у агарозну мрежу.

Електрофоретско хватање је равнотежа између електрофоретске силе (повлачење кружне плазмидне ДНК на замку) и дифузије (омогућавање кружној плазмидној ДНК да побегне из замке). Дакле, велики кружни молекули имају веће шансе да буду заробљени него мањи ДНК. Суперумотану ДНК је теже ухватити у клопку због мале величине уврнуте ДНК.


РЕЗУЛТАТИ И ДИСКУСИЈА

Идентификација и карактеризација одговарајућих боја

На слици 1, траке Н1–Н7 представљају негативно наелектрисане (ањонске) боје које су мигрирале ка аноди (позитивној електроди) током електрофорезе. Траке П1–П7 представљају позитивно наелектрисане (катјонске) боје које су мигрирале ка катоди (негативна електрода) током електрофорезе. Како позитивно наелектрисане боје мигрирају у супротном смеру од стандардне електрофорезе ДНК гела, гел који садржи ове боје се ставља у резервоар тако да су бунари ближе аноди уместо катоди, тако да боје могу мигрирати кроз гел ка катоди.

Миграција боја у гел електрофорези. Агарозни гел (1%), 1Кс ТБЕ пуфер, електрофореза на 100 В током 45 мин. Погледајте табелу И за идентитет боја. Траке Н1–Н7 мигрирао према аноди и траке П1–П7 мигрирао према катоди. Гелови су били оријентисани за миграцију боја у одговарајућем правцу. Траке представљају раздаљину коју мигрирају фрагменти ДНК назначених величина у паровима база (бп).

Средња удаљеност коју мигрира свака трака боје је табеларно приказана у Табели И. Траке представљају мигриране удаљености фрагмената ДНК, од 250 парова база (бп) до 10,000 бп, 1 кб ДНК лествице (Промега) под идентичним условима.

Стандардна крива удаљености миграције у односу на лог10 бп величина ДНК фрагмента је конструисана и коришћена за процену еквивалентне „величине“ сваке боје на основу удаљености коју је боја мигрирала. Имајте на уму да се мигрирано растојање мери на предњој ивици боје, а на миграцију боје утиче неколико фактора као што су концентрација гела, тип гела и тип и пХ пуфера [1, 4, 5] (видети Сл. 2). Дакле, еквивалентна „величина“ сваке боје у односу на линеарне ДНК фрагменте наведене у Табели И је номинална, али се може користити у наставним експериментима као што је касније објашњено.

Растојање које су мигрирале боје у агар-агар геловима и растворима електролита.

Имајте на уму да позитивно наелектрисане боје мигрирају у супротном смеру од ДНК у електричном пољу. Одговарајућу пажњу треба посветити решавању конфузије или погрешног схватања ученика ако постоји потреба да се користе позитивно наелектрисане боје за симулацију узорака ДНК у гел електрофорези. С друге стране, негативно наелектрисане боје мигрирају чисто и поновљиво, тако да су идеалне замене за узорке ДНК.

Неколико других боја, кармин, фенол црвена, бромокрезол зелена и неутрална црвена су тестиране и утврђено је да не мигрирају током електрофорезе на пХ 8,0.

Идентификација и карактеризација одговарајућих електролита

Уобичајене лабораторијске соли су растворене до коначних 10 мМ у води (видети табелу ИИ). Измерени су пХ и проводљивост. Струја која тече током електрофорезе забележена је из очитавања струје Био-Рад напајања. Сви апарати су били на почетној (собној) температури од 22 °Ц. Забележен је пораст температуре електролита у резервоару на крају рада.

Електролит Формула Цонц. пХ Специфична проводљивост (μс цм −1 ) Електрофореза на 60 В у трајању од 60 мин
Опсег струје (мА) Темп. повећање (°Ц)
Трис–борат–ЕДТА ТБЕ 8.0 620 17–19 2.0
Натријум ацетат ЦХ3ЦООНа 10 м М 7.5 702 19–22 2.4
Натријум бикарбоната НаХЦО3 10 м М 8.2 767 21–22 2.5
Динатријум хидроген фосфат На2ХПО4 10 м М 8.7 1590 39–59 5.2
Дикалијум хидроген фосфат К2ХПО4 10 м М 8.8 2017 49–66 6.7
Калијум хидроксид КОХ 10 м М 11.6 1860 24–30 3.7

Натријум бикарбонат (10 м М ) је лако доступан електролит који се лако припрема и који се блиско подудара са 1Кс ТБЕ пуфером за пХ и проводљивост, што га чини погодном алтернативом за гел електрофорезу боја. Натријум ацетат (10 м М ) је такође погодна замена. Фосфатни пуфери су имали већу проводљивост, што је омогућавало да веће струје теку кроз резервоар, а то је повремено резултирало локализованим загревањем које је омекшало делове агар гела. Користећи К2ХПО4 и На2ХПО4 при концентрацијама између 1 и 5 м М минимизирао је овај проблем.

Електрофореза коришћењем електролита са проводљивошћу нижом од проводљивости 1× ТБЕ смањила је проток струје и успорила миграцију боја. Могуће је користити електролите ниске проводљивости на високим напонима да би се убрзала електрофореза [13, 14]. Ово би могло бити корисно ако је време наставе ограничено, али ово није истражено јер би употреба виших напона захтевала специјализовану опрему, повећала опасност од електричне струје, а самим тим и неприкладна за учионицу.

Остали електролити су такође тестирани, али је утврђено да нису одговарајући. Калијум јодид и натријум тиосулфат су производили преципитат, док је натријум хлорид, предложен у неким протоколима [6, 8], имао високу проводљивост и развијао је непријатан мирис хлора током електрофорезе.

Идентификација и карактеризација одговарајућих комбинација боје-електролит

Примећено је да би неке боје промениле нијансу или интензитет када се помешају са одређеним електролитима. Ова интеракција је систематски мерена мешањем раствора боје са растворима електролита и одређивањем промене апсорбанције (видети табелу ИИИ). Око 50 μл сваке боје (серијски разблажено до 0,0125%) помешано је са 150 μл електролита у микротитарској плочи са 96 јажица. Забележена је разлика у апсорпцији (разлика у оптичкој густини, дОД1) у поређењу са контролним узорцима од 50 μл боје у 150 μл воде. Очитавања апсорпције за сваку боју су направљена на таласној дужини вршне апсорпције у контролном узорку, утврђеној из спектра апсорпције контролних узорака. Сва очитавања су направљена у Био-Рад Бенцхмарк Плус спектрофотометру за микроплоче.

Дие Таласна дужина вршне апсорпције (нм) Промена апсорпције када се боја помеша са електролитом
ЦХ3ЦООНа НаХЦО3 На2ХПО4 К2ХПО4 КОХ
Ксилен цијанол ФФ 520 −0.084 −0.079 +0.009 −0.047 −0.583
Метил црвено 460 +0.199 +0.020 +0.036 +0.047 +0.047
Метил наранџаста 464 −0.128 −0.068 −0.167 −0.176 −0.016
Крезол црвена 435 −0.237 −0.692 −0.039 −0.603 −0.739
Бромофенол плаво 589 +0.224 +0.262 −0.005 −0.253 +0.151
Оранге Г 475 −0.128 −0.005 +0.026 −0.042 −0.075
Понцеау С 615 −0.006 +0.004 −0.003 −0.013 −0.384
Јанус зелен 600 −0.220 −0.151 −0.081 −0.222 −0.394
Бриљантно зелено 625 1.566 1.692 −0.019 1.687 Д.Ц.
Метил љубичаста 581 −0.021 +0.182 −0.052 −0.136 1.580
Шафранин О 512 −0.072 −0.080 −0.080 −0.009 −0.171
Кристално љубичаста 589 −0.151 3.178 −0.051 1.585 Д.Ц.
пиронин И(Г) 547 −0.177 1.769 −0.094 −0.266 2.193
Метил зелено 632 −0.022 −0.170 −0.071 −0.120 Д.Ц.
  • „Д.Ц.“ означава да је комбинација потпуно обезбојена. Негативна дОД вредност указује на смањење апсорпције боје растворене у електролиту у поређењу са бојом само у води и на тај начин указује на промену боје или смањење интензитета боје. Насупрот томе, позитивна вредност дОД може указивати на повећање интензитета боје. Цифре у курзиву означавају смањење за више од 1,0 ОД јединица.

Генерално, негативно наелектрисане боје остају стабилне у заменским електролитима, али неке позитивно наелектрисане боје показују значајно смањење апсорбанције, што одговара губитку интензитета боје. Комплетна плоча од седам позитивно наелектрисаних боја задржала је своју боју само у На2ХПО4.

Све боје су биле стабилне када су коришћене у 1Кс ТБЕ пуферу (видети слику 1).

Идентификација и карактеризација одговарајућих комбинација електролита

Плоча гела која се користи у електрофорези треба да има одговарајућа физичка својства слична утврђеним формулацијама агарозног гела. Гелови су направљени суспендовањем агар праха у 10 м М растворима електролита до коначне концентрације од 1% (в/в) и доведени до кључања у микроталасној пећници. После кратког периода хлађења, растопљени гел је сипан у посуду за ливење минигела са уметнутим чешљем. Након стврдњавања, гелови су вођени на 60 В током 60 минута у својим електролитима да би се проверило задржавање облика и конзистенције.

Погодни су само раствори електролита са базним пХ, пошто је употреба раствора са киселим пХ ометала постављање агар гелова, што је резултирало веома меким и лепљивим геловима (подаци нису приказани). Табела ИВ показује својства тестираних комбинација гел-електролит. Уопштено говорећи, откривено је да калијум хидроксид није био погодан за употребу у гел електрофорези, јер гелови направљени са овим електролитом имају тенденцију да имају боје и меку, лепљиву текстуру која не одржава облик бунара.

Електролит Агар-агар (бренд Сваллов Глобе) Агар-агар (бренд руже) Коњаку желе (бренд Ред Ман) Коњаку желе (бренд Јим Виллие) Бактериолошки агар (оксоид)
ЦХ3ЦООНа Р Р
НаХЦО3 М М
На2ХПО4 Р Р
К2ХПО4 М М
КОХ Ц Ц, А Ц, А Ц, А Ц
  • √ = погодан за електрофорезу А = гел је лепљив Ц = гел има боју и/или је мутан М = гел се топи током електрофорезе Р = гел се пребрзо веже.

Гелови на бази Коњакуа такође су били неприкладни, као они направљени са На2ХПО4 и ЦХ3ЦООНа би се сувише брзо стврднуо да би правилно излио гел за плоче, док би они направљени са К2ХПО4 и НаХЦО3 имају тенденцију да се топе током електрофорезе. Уочено је да су током електрофорезе струјни проток и проводљивост кроз резервоар који садржи гелове на бази коњакуа били већи него за гелове направљене од агара или агарозе, вероватно зато што комерцијалне мешавине праха коњаку садрже једињења која се испирају у електролит у резервоару, дакле повећава проводљивост.

Електрофореза боја у одабраним комбинацијама гел-електролит

Панел боја је изабран за употребу у електрофорези, на основу њихове стабилности у електролитима који ће се користити у резервоарима за електрофорезу. То су били ксилен цијанол ФФ, метил наранџаста, крезол црвена, бромофенол плава, наранџаста Г и понцеау С. Миграција сваке боје је забележена после електрофорезе на 60 В током 60 минута у минигелу. Боје су коришћене појединачно и као мешавина свих шест боја заједно на комбинацијама гел-електролита које су идентификоване као погодне у Табели ИВ. Мешавина боје се чисто одваја током електрофорезе у агарозно-ТБЕ гелу и не реагује или не реагује једна са другом током електрофорезе (подаци нису приказани).

Слика 2 приказује растојање које мигрира панел од шест негативно наелектрисаних боја у геловима направљеним од 1% агар-агара (бренд Сваллов Глобе) у одабраним електролитима. Растојање које су мигрирале боје се незнатно разликовало у сваком електролиту и чинило се да варира са пХ. Гелови направљени од агар-агар марке Росе и бактериолошки агар показали су сличне резултате (подаци нису приказани). Генерално, што је виши пХ електролита, то су боје даље мигрирале. У сва четири коришћена електролита, крезол црвена је мигрирала са бромофенол плавом, док би у ТБЕ пуферу крезол црвена мигрирала мање од бромофенол плаве (видети Слику 1 и Табелу И). Чини се да ово не зависи од пХ вредности јер је пХ ТБЕ 8,0, што је вредност између вредности ЦХ3ЦООНа и НаХЦО3.

Симулација ДНК гел електрофореза

Гел електрофореза ДНК узорака се обично изводи у хоризонталном „подморском“ агарозном гелу уроњеном у проводни пуфер. Када се струја прође кроз пуферски раствор у резервоару за електрофорезу, ствара се електрично поље. Фосфатне групе у ДНК су негативно наелектрисане, дајући молекулу ДНК укупно негативно наелектрисање. У електричном пољу, ДНК се креће ка позитивно наелектрисаној електроди (аноди) коморе за електрофорезу [1].

Фрагменти ДНК су раздвојени по величини пошто мањи фрагменти мигрирају даље кроз поре гела матрикса од већих фрагмената. Мигрирано растојање је обрнуто пропорционално дневнику10 молекулске тежине фрагмента ДНК. Брзина миграције је одређена јачином поља примењеног на гел. Јачина електричног поља је директно пропорционална разлици потенцијала (примењеном напону) и обрнуто пропорционална дужини електричног поља [4, 5]. Повећање напона или смањење растојања између електрода може повећати јачину поља, чиме се повећава брзина миграције ДНК фрагмента. Међутим, што је већи примењени напон, то је већа струја која тече кроз резервоар за електрофорезу, што резултира стварањем топлоте која би могла да растопи гел [4, 5].

После електрофорезе, агарозни гел је затим обојен етидијум бромидом. Етидијум бромид се везује за молекуле ДНК и флуоресцира под УВ светлошћу, откривајући положај „трака“ ДНК [1, 2]. „ДНК лествица“ (маркер) која се састоји од фрагмената ДНК познатих величина може се покренути поред ДНК узорака на гелу. Величина непознатог фрагмента узорка може се одредити упоређивањем његове удаљености која је мигрирала са растојањем фрагмената ДНК на лествици [1, 4, 5].

Овде представљени заменски материјали могу се користити у целини или делимично за симулацију електрофорезе ДНК гела за употребу у наставним апликацијама. Међутим, треба имати на уму одређене тачке да би се ученицима управљало концептуалним разумевањем укључених процеса. Треба водити рачуна да шарена природа замене за боје не збуни ученике и не резултира погрешним схватањима. Важно је, на пример, нагласити да боја не одређује „величину” симулираног ДНК фрагмента и да се употреба боја овде разликује од бојења ДНК у сврху визуелизације.

Још једна кључна тачка је да молекуларна тежина боје не одређује само растојање које мигрира у гелу. За разлику од ДНК, једињења боје могу имати различите густине наелектрисања једна у односу на другу. Дакле, молекуларна тежина боје нема директну везу са очигледном „величином“ симулиране ДНК траке коју је формирала боја.

За апликације где је гел електрофореза на бази боје намењена да симулира електрофорезу ДНК гела у сврху одређивања молекуларне величине „непознатих фрагмената ДНК“ конструисањем стандардне криве удаљености која је мигрирала у односу на молекулску тежину „познатих фрагмената ДНК“, номинална "величина" сваке траке дата је у Табели И. Привидна "величина" сваке боје је процењена на основу стандардне криве генерисане на удаљеностима које су мигрирали ДНК фрагменти стандардне ДНК лествице.

Ове вредности се могу користити заједно са измереном раздаљином коју су мигрирале одговарајуће боје у студентским експериментима да би се конструисала стандардна крива која се може користити за процену, на пример, „величине“ боје која није присутна у мешавини мердевина. Имајте на уму да су вредности прилично тачне за концентрације гела од (1,0 ± 0,2)%.

Импровизована гел електрофореза

Тамо где су доступни комерцијални апарати за електрофорезу, обезбедите најконзистентније и најбезбедније серије гела. Иначе, импровизација са лако доступним материјалима је релативно једноставна и доступни су протоколи [8, 9]. Уливање гела у мали полипропиленски контејнер за складиштење хране, који се затим користи ин ситу за електрофорезу [8], посебно је ефикасан.

Једно корисно побољшање описаног дизајна је изливање гела са „чешљем“ да би се произвеле бунарчиће за држање узорака боје које треба убацити уместо да се користе траке филтер папира натопљене бојом уметнуте директно у гел. Чешаљ се може узети из постојећег сета за електрофорезу или се може направити резањем прореза у комад пластичне плоче дебљине 1–1,5 мм. Иако ово захтева више напора да се чешаљ постави и подупре током ливења, траке боје изгледају боље дефинисане са мање размазивања када се уметну у бунаре.

Такође препоручујемо да побољшате подешавање коришћењем угљеничних шипки пречника 4–5 мм за електроде. Електроде од платине или нерђајућег челика су пожељније због њихове отпорности на корозију, али то су скупи и специјализовани артикли. Често се користе голе бакарне жице [8, 9], али то има недостатак што производи обојени талог и постаје кородиран у процесу. Карбонске шипке имају већу отпорност, али не кородирају и могу се поново користити.

Бакарна жица са крокодил штипаљком била је причвршћена на крај сваке угљеничне шипке. Крокодил штипаљка и крај карбонске шипке су безбедно умотани лабораторијским заптивним филмом („парафилм“) како би се спречило да метал копче дође у контакт са раствором електролита. Након уливања гела у посуду за храну (~15 цм к 10 цм, или 6” к 4”), гел је исечен паралелно са дугим странама посуде око 2 цм од зида и траке гела на обе стране. крајеви су били подигнути. Ставите по једну угљеничну шипку у свако од два створена корита, тако да буду паралелна једно са другим, али са причвршћеним електричним жицама на супротним крајевима. Овако распоређено, прилично униформно електрично поље пролази кроз централни део гела, омогућавајући ефикасно електрофоретско одвајање боја на 12 В у року од 60 минута (видети слику 3).

Домаћи апарат за импровизовану гел електрофорезу. 1% агар-агар гел, 10 м М раствор електролита натријум бикарбоната. Око 7,5 μл сваког раствора боје напуњено по бунарчићу и примењено 12 В током 60 мин. Све боје су направљене у 20% раствору глицерола. Ланес (с лева на десно): 0,1% ксилен цијанол ФФ, 0,1% бромофенол плава, 0,2% наранџаста Г, 0,1% понцеау С. Следеће четири траке се понављају. Јачина поља у овој кућној комори је ∼2 В цм −1 .

Ради безбедности и минимизирања нагомилавања топлоте у малом контејнеру, треба користити само ниске напоне (<24 В). 12 В ДЦ трансформатори опште намене (200–500 мА) су лако доступни и погодни за ову употребу. Утврђено је да је струјни ток у опсегу од 12–20 мА. Ако се желе виши напони између 12 и 24 В да би се убрзао процес, а одговарајући лабораторијски извори напајања нису доступни, онда се могу користити извори напајања за преносне рачунаре јер многи од њих имају излазни напон у овом опсегу. У свим случајевима треба водити рачуна да се избегне кратак спој, као што је спречавање да електроде дођу у контакт једна са другом.

Миграција боја у оквиру ниске јачине поља импровизованог резервоара је спора. Дакле, најбоље боје за употребу су оне које најбрже мигрирају како би се смањило време потребно да се виде јасно раздвојене траке. Понцеау С, наранџаста Г и бромофенол плава мигрирају најбрже, док је ксилен цијанол ФФ користан као четврта боја јер мигрира најспорије. Све четири боје заједно стварају шарени, добро раздвојени сет трака.

Активности у учионици коришћењем гел електрофорезе на бази боје

Одређивање величине непознатог ДНК фрагмента – Једна од свакодневних примена ДНК гел електрофорезе у истраживачким лабораторијама је анализа фрагмената ДНК генерисаних експериментом као што је амплификација ланчане реакције полимеразом (ПЦР) или екстракција плазмидне ДНК из бактерија. Одређивање величине фрагмента ДНК је основна техника и може се лако симулирати припремањем „мердевине за бојење“ и употребом још једне или две боје као „непознате ДНК“.

Боје одабране за мердевине треба добро раздвојити. Мердевине за бојење треба да буду припремљене од нуле, а не да се праве једноставним мешањем неколико боја заједно, што би резултирало разблаживањем појединачних боја. Боје одабране за мердевине треба извагати и затим ставити у исту боцу пре додавања исте запремине 20% раствора глицерола као да је то само једна боја.

Узорак „непознате ДНК“ би идеално требало да буде боја која није међу онима које су укључене у мешавину ДНК лествице. Ученици затим могу да користе гелове са мешавином мердевина и непознатим узорком, конструишу график стандардне криве користећи номиналне вредности „бп сизе” дате у Табели И, а затим користе график да процене величину непознатог узорка [1].

ДНК отисак прста – Можда би најједноставнија и вероватно најчешћа примена гел електрофорезе на бази боје била симулација „Форензичког ДНК отиска прста“. Ово се може постићи припремом неколико варијација мешавина боја које представљају ДНК профил неколико „осумњичених“ и додељивањем дупликата препарата једног од њих као узорка „ДНК места злочина“. Варијација овога би била ослобађање осумњичених уз помоћ јединственог узорка „ДНК места злочина“.

Идентификација генотипа – Популаран експеримент заснован на ПЦР-у који се користи у настави у учионици је да се одреди генотип сваког ученика у одељењу на одређеном месту, као нпр. Алу ПВ92 [ 1 ]. Генотип се визуелизује коришћењем електрофорезе у агарозном гелу за присуство једне или обе траке ДНК. Свака трака представља један од два могућа алела за ген или локус. Ова вежба се такође може користити за подучавање појмова из наслеђа и популационе генетике. Упарене боје сличне боје, као што су метил наранџаста и наранџаста Г, крезол црвена и понсо С, или катјонске боје, бриљантно зелена и метил зелена, могу се користити за симулацију два алелна облика ДНК амплифициране у таквом експерименту и на тај начин покривају многе кључне наставне тачке, без потребе за ПЦР.

Поред стандардних вежби науке о ДНК које су раније поменуте, гел електрофореза на бази боје такође би се могла користити као систем за вођење учења заснованог на упитима, где би ученици могли, на пример, да истраже ефекат концентрације гела или јачине поља на мигрирано растојање. Други су такође предложили употребу и катјонских и ањонских боја на истом гелу (са отвором за пуњење формираним у центру гела) како би повезали дискусију са концептима физичке науке, као што је ефекат наелектрисања на смер миграције у електрично поље [7] (видети слику 4).

Примери наелектрисаних боја. Структуре два примера боја. Наранџаста Г је ањонска или негативно наелектрисана боја. Пиронин И (такође познат као пиронин Г) је катјонска, позитивно наелектрисана боја [12].


Протоколи

Део 1: Покрените свој гел

  1. Додајте 2,5 &микрола пуну боју у узорке М13КО7 од последњег пута. Боја за пуњење садржи ксилен цијанол као боју за праћење како би се пратио напредак електрофорезе (тако да не бисте избацили ни најмање фрагменте са краја вашег гела!), као и глицерол који помаже узорцима да потоне у бунар.
  2. Померите епендорфове епрувете да бисте помешали садржај, а затим их брзо окрените у микрофуги да бисте садржај епрувета довели на дно.
  3. Напуните гел редоследом приказаним у табели испод. Једна група ће учитати у бунаре од 1 до 3, друга група ће учитати у бунаре од 5 до 7. Да бисте убацили своје узорке, увуците 25 &микрола у врх вашег П200. Спустите врх испод површине пуфера и директно преко бунара. Ризикујете да пробушите дно бунара ако врх спустите предалеко у сам бунар (добро бушење = лоше!). Избаците свој узорак у бунар. Не отпуштајте клип пипете све док не уклоните врх из кутије за гел (или ћете увући узорак назад у врх!).
  4. Када су сви узорци напуњени, причврстите кутију са гелом на напајање и пустите гел на 125 В не више од 45 минута.
  5. Биће вам показано како да фотографишете свој гел и изрезујете релевантне траке ДНК.
Траке, узорци и запремине за учитавање.
ЛАНЕС УЗОРЦИ ВОЛУМЕ ЗА УЧИТАВАЊЕ
1 1 кб Маркер 5 &микрол
2 М13КО7 Узорак необрезан Сав волумен реакције (

Пуњење гела. (Слика МИТ ОпенЦоурсеВаре.)

Део 2: Изоловање/пречишћавање ДНК

Да бисте очистили своју ДНК од агарозе, користићете комплет који продаје Киаген. Реагенси имају неинформативна имена и њихов садржај је власнички. Комплет за пречишћавање агарозе захтева везивање ДНК за спин колону са силика-гел мембраном, испирање соли и елуирање ДНК са мембране.

  1. Додајте 550 &микрола КГ на своју кришку агарозе.
  2. Инкубирајте на 50°Ц 10 минута док се агароза потпуно не раствори. Сваких неколико минута можете уклонити епрувету са топлоте на 50&дегЦ да бисте протресли садржај. Ово ће помоћи да се агароза раствори.
  3. Додајте 125 &микрола изопропанола у своју епендорфову епрувету.
  4. Набавите КИАкуицк спин колону (љубичаста) са сабирном цевчицом (провидна) од наставног факултета. Означите центрифугирану колону (не епрувету за сакупљање!), а затим пипетирајте растворену мешавину агарозе на врх колоне. Микробугирајте колону у епрувети за сакупљање 60 секунди. Максимални капацитет КИАкуицк колона је 800 &микрола! If you have more than 800 µl in your mixture, you will need to repeat this step.
  5. Discard the flow-through in the sink and replace the spin-column in its collection tube. Add 750 µl of PE to the top of the column and spin as before.
  6. Discard the flow-through in the sink and replace the spin-column in the collection tube. Add nothing to the top but spin for 60 seconds more to dry the membrane.
  7. Trim the cap off a new eppendorf tube and label the side with your team color and the date. Place the spin-column in the trimmed eppendorf tube and add 30 µl of EB to the center of the membrane.
  8. Allow the column to sit at room temperature for one minute and then spin as before. The material that collects in the bottom of the eppendorf tube is your purified plasmid backbone, ready to be ligated. Give it to the teaching faculty who will store it with your insert until next time.

Part 3: Titering Phage

One technique you will see several times this term is plating for plaques. The idea of this technique is simple. Since phage infection slows down the growth of bacteria, any phage-infected cell will grow less quickly than an uninfected one, giving rise to a zone that is more clear on a lawn of fully grown cells. This zone is called a plaque and by counting the number of plaques formed, it is possible to measure the number of infective phage in the sample you are testing. The number of infected phages is measured as PFUs, which is "plaque forming units per ml."

Plaques formed by bacteriophage upon infection of susceptible bacteria. Source: Assorted Views of Bacteriophage Plaques. © Quiroz. Licensed for use, ASM MicrobeLibrary.

  1. Start by placing 6 LB plates in the 37° incubator to prewarm them. If there is any condensation on the surface of the plates, then you can leave the lids slightly ajar to dry the plate surface.
  2. Aliquot 200 µl of bacteria into 6 small, sterile test tubes. The bacteria you are using are the strain ER2267 since this strain has a selectible F'. Label the tops of each tube with a colored sticker and one of the following: none, none, 10 -4 E4, 10 -6 E4, 10 -4 K07, 10 -6 K07.
  3. The teaching faculty have two phage stocks for you to compare, an M13KO7 phage stock and a stock of another M13 phage called E4. You will need to serially dilute each stock, making stepwise 1/100 dilutions in eppendorf tubes. For example, add 10 µl of a phage stock to 990 µl sterile water for a 10 -2 dilution, then repeat, using 10 µl of the 10 -2 dilution into 990 µl sterile water to make a 10 -4 dilution. Vortex the dilutions before removing any liquid and change pipet tips to prepare each new dilution. Continue serially diluting the phage to final concentrations that are 10 -4 th and 10 -6 th as concentrated as the starting stock.
  4. Mix 10 µl of one of the 10 -4 dilutions into a tube with bacteria.
  5. Mix 10 µl of one of the 10 -6 dilution into another tube with bacteria.
  6. Repeat with the dilutions of the other phage stock.
  7. One of the teaching faculty will show you how to mix 3 ml of top agar into one of the uninfected samples you have prepared and how to pour the molten mix onto the surface of a prewarmed LB plate.
  8. You and your partner should add top agar to the other uninfected sample and the four phage infected ones.

Allow the top agar to solidify by leaving the plates on the bench at least 5 minutes then stack them and wrap them with your colored tape and finally move them to the 37° incubator to grow overnight. One of the teaching faculty will remove them from the incubator tomorrow and store them for you until next time.


Principle:

The negatively charged DNA molecules migrate towards the positive charge under the influence of constant current, thus the separation depends on the mass and charge of DNA. The DNA molecules are forced to move through the agarose gel pores. The rate of the migration depends on,

      • The strength of the field
      • The hydrophobicity of the DNA
      • The ionic strength of the buffer
      • The size and shape of the DNA
      • The temperature of the buffer

      Three of the important factors that affect DNA migration rate are,

      As we discussed earlier if the concentration of agarose is lower, the DNA can migrate easily and faster and vice versa.

      The supercoiled DNA migrates faster than the linear DNA and circular DNA.

      The supercoiled form of DNA is more compact than other forms and this is the reason for its speedy migration.

      If the size of a DNA is larger, the migration rate of it is lower and therefore PCR product of several hundred base pairs migrates faster than the total genomic DNA.


      When is gel electrophoresis used to separate DNA fragments?

      Gel electrophoresis can be used for a range of purposes, for example:

      • To get a DNA fingerprint for forensic purposes
      • To get a DNA fingerprint for paternity testing
      • To get a DNA fingerprint so that you can look for evolutionary relationships among organisms
      • To check a PCR reaction.
        See the video clip: Using gel electrophoresis to check a PCR reaction
      • To test for genes associated with a particular disease.
        Find out more in the article, Gel electrophoresis can be used to find genes associated with a disease.

      Now this image is pretty good but what is the problem?

      Here the annealing temperature of the primer is not selected properly. So the primer is compromised with other complementary sequences present in the genome. The annealing temperature is too low in comparison with its actual annealing temperature.

      Due to this reason, more than 4 bands of PCR amplicons are observed in the gel. Further, see the green arrow, a bubble hindered the separation of the DNA ladder.

      Conclusively, the PCR is not performed with the optimum PCR conditions.


      SYBR Green

      The SYBR Green I and II stains (again, marketed by Molecular Probes) are optimized for different purposes. Because they bind to DNA, they are still considered potential mutagens and because of that, they should be handled with care.

      SYBR Green I is more sensitive for use with double-stranded DNA, while SYBR Green II, on the other hand, is best for use with single-stranded DNA or RNA. Like the popular ethidium bromide stain, these highly sensitive stains fluoresce under UV light.

      Both SYBR Green I and II are recommended by the manufacturer to be used with "254 nm epi-illumination Polaroid 667 black and white film and a SYBR Green gel stain photographic filter" to achieve detection of 100 pg of RNA or single-strand DNA per band.


      Successful DNA Plasmid Preps

      Although DNA plasmid preps can return multiple forms of DNA, there is only one kind you want for successful cloning and transfection: supercoiled. Make sure you know how to increase your recovery of good quality supercoiled DNA. Did this help you understand why you get three bands when running plasmid DNA on agarose gels? Do you have any other plasmid prep tips? We’d love to hear in the comments.

      Originally published October 8, 2014. Reviewed and republished April 2021.


      Погледајте видео: Методы молекулярной биологии. Электрофорез в агарозном геле (Август 2022).