Информације

Зашто бисте мешали полимеразе у ПЦР?

Зашто бисте мешали полимеразе у ПЦР?



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Читао сам приручник за комплет који захтева да појачате ДНК ПЦР-ом пре него што га анализирате у комплету. Приручник предлаже мешање полимераза за лектуру и полимеразе без лекторирања:

За ПЦР производе дужине >2500 бп, користите мешавину ДНК полимеразе која садржи Так ДНК полимеразу допуњену ДНК полимеразом за коректуру

Како би ово побољшало појачање дугих производа? Предлаже се коришћење само лекторске полимеразе за фрагменте испод 2500 база. Да ли додавање нелекторске полимеразе побољшава брзину? Имам ТАК и ПФУ Ултра, али оба упутства кажу да користим време продужења од 1 минута по кб.


Так полимераза је прилично брз ензим (брзина синтезе је око 1 кб/мин), али недостатак је у томе што нема 3'-5' егзонуклеазу активност која би омогућила лекторисање новосинтетизоване ДНК. Ово доводи до увођења грешака и шанса да их добијете већа је што је дужи ДНК који желите да синтетишете.

Полимеразе које су у стању да лекторишу (које имају активност егзонуклеазе) попут Пфу имају много нижу стопу грешке, али су с друге стране такође много спорије, типично око 0,5 кб/мин. Пфу је такође скупљи од Так полимеразе. Погледајте табелу 1 из референце 1 испод:

Да бисте комбиновали предности обе полимеразе, обично користите мешавину Так и Пфу. Тада добијате високу процесност Так-а у комбинацији са капацитетом лектуре Пфу-а и добијате добре приносе ДНК са малом количином мутација. Такође погледајте референцу 2 за детаље о овом систему.

Референце:

  1. Поређење стопе грешке током ланчане реакције полимеразе помоћу ДНК полимеразе
  2. Ефикасна амплификација дугих мета из клонираних уметака и људске геномске ДНК.

Изаберите праву ДНК полимеразу за ПЦР

Нев Енгланд БиоЛабс има много полимераза дизајнираних за употребу у ПЦР. Како одлучујете који вам је потребан? Ово ће првенствено зависити од ваше апликације. Прва одлука коју ћете вероватно донети је да ли вам је потребно појачање високе верности или стандардно појачање? Ако планирате да користите свој ПЦР производ у наредним експериментима као што су експресија протеина или секвенцирање, желите да минимизирате укључивање грешака и требало би да изаберете полимеразу високе верности. Ако само треба да видите да ли имате ПЦР производ или не, на пример, ако потврђујете да ваш плазмид има уметак, онда ће стандардни ПЦР или ПЦР за колоније бити одговарајући.

За амплификацију високе верности, препоручујемо да почнете са ДНК полимеразом високе верности К5, пошто она има најнижу доступну стопу грешака, а такође је оптимизована за заиста робусне перформансе у АТГЦ спектру. За стандардни ПЦР или ПЦР у колонијама, препоручујемо да почнете са ОнеТак ДНК полимеразом, која је такође оптимизована за одличне перформансе чак и са тешким шаблонима као што је ГЦ богат.

Затим, да ли треба да подесите своје реакције на собној температури? Да ли је специфичност изазов? Ако је тако, верзија полимеразе са врућим стартом ће бити идеална.

Ваша следећа одлука ће бити формат полимеразе. Ради лакшег коришћења, имамо мастер мешавине које садрже ензим, пуфер и дНТП, као и формате мастер мешавине за брзо учитавање који такође садрже боју за пуњење тако да можете да учитате свој ПЦР директно на гел. И наравно, имамо и самосталне полимеразе.


Корекција ДНК полимеразом

3´→ 5´ лекторски домен егзонуклеазе је својствен већини ДНК полимераза. Омогућава ензиму да провери сваки нуклеотид током синтезе ДНК и исече неусклађене нуклеотиде у правцу од 3´ до 5´. Домен за коректуру такође омогућава полимерази да уклони неупарене 3´ нуклеотиде који прележу и стварају тупе крајеве. Протоколи као што су ПЦР високе верности, полирање 3´ превиса и синтеза другог ланца високе верности захтевају присуство 3´→ 5´ егзонуклеазе.

Насупрот томе, неке апликације су побољшане употребом полимераза без активности лектуре. На пример, ефикасност обележавања ДНК је побољшана одсуством лектуре, јер спречава ексцизију уграђених база, омогућавајући коришћење мање модификоване базе.

Тестови модификоване инкорпорације база, као што су вишебојна анализа генске експресије, мапирање гена и ин ситу хибридизација, која користи ДНК која је обележена флуоресцентним нуклеотидом да би се олакшала детекција, добро се поклапају са НЕБ-овим ДНК полимеразама са недостатком егзонуклеазе. Полимеразе без коректуре су такође незаменљиве када се делимично попуњавају 5´ препусти само одабраним дНТП. Додавање нетемплатираног дНТП на 3´ крају тупих крајева, што је услов за ТА клонирање, такође је промовисано ензимима који не читају лектуру. Поред неколико полимераза дивљег типа у свакој од ових категорија, НЕБ нуди генетски измењене верзије неколико коректурних полимераза, где је активност егзонуклеазе при лекторисању ослабљена или укинута.


Параметри који утичу на ПЦР

Основне компоненте ланчане реакције полимеразе:

    Термостабилна ДНК полимераза која катализује синтезу ДНК зависну од шаблона:

У зависности од способности, верности, ефикасности за синтезу великих ДНК производа, сада је доступан широк избор ензима. За рутинске ПЦР, Так полимераза (0,5-2,5 јединица по стандардној реакцији од 25-50 уЛ) остаје ензим избора. Специфична активност већине комерцијалних препарата Так је

80.000 јединица/мг протеина. Пошто је ефикасност продужетка прајмера са Так полимеразом генерално

0,7, ензим постаје ограничавајући када се у реакцији акумулира 1,4*1012 до 7*1012 молекула појачаног производа.

Дизајн олигонуклеотидног прајмера као најважнији фактор који утиче на ефикасност и специфичност реакције амплификације, пажљив дизајн прајмера је неопходан да би се добили жељени производи са високим приносом, да би се потиснула амплификација нежељених секвенци и да би се олакшала накнадна манипулација амплификованим производ. Пошто прајмери ​​тако снажно утичу на успех или неуспех ПЦР протокола, иронично је да су смернице за њихов дизајн углавном квалитативне и да су засноване више на здравом разуму него на добро схваћеним термодинамичким или структурним принципима.

Дизајн олигонуклеотидних прајмера за ПЦР

У одређеним ситуацијама може бити пожељно амплификовати неколико сегмената циљне ДНК истовремено. У овим случајевима се користи реакција амплификације под називом "мултиплек ПЦР" која укључује више од једног пара прајмера у реакционој мешавини. Стандардне реакције садрже неограничену количину прајмера, типично 0,1-0,5 μМ сваког прајмера (6*1012 до 3*1013 молекула). Ова количина је довољна за најмање 30 циклуса амплификације 1 кб сегмента ДНК. Веће концентрације прајмера погодују погрешном прајмирању што може довести до неспецифичне амплификације.

Стандардни ПЦР садрже еквимоларне количине сва четири дНТП. Концентрације од 200-250 μМ сваког дНТП препоручене за Так полимеразу у реакцијама које садрже 1,5 мМ МгЦл2. У реакцији од 50 уЛ, ове количине би требало да омогуће синтезу

6-6,5 μг ДНК што би требало да буде довољно чак и за мултиплексну реакцију у којој се истовремено користи осам или више парова прајмера. Високе концентрације дНТП-а (&гт4мМ) су инхибиторне, можда због секвестрације Мг2+. Међутим, задовољавајућа количина амплифицираног производа може се произвести са концентрацијама дНТП од само 20 μМ-0,5-1,0 пМ амплифицираног фрагмента

1 кб у дужини. Да би се избегли проблеми, залихе дНТП-а треба чувати на -20 о Ц у малим аликвотима које треба одбацити након другог циклуса замрзавања или одмрзавања. Током дуготрајног складиштења на -20 о Ц, мале количине воде испаравају, а затим се смрзавају на зидовима бочице. Да би се минимизирале промене у концентрацији, бочице које садрже дНТП растворе треба центрифугирати, након одмрзавања, неколико секунди у микро центрифуги.

Све термостабилне ДНК полимеразе захтевају слободне двовалентне катјоне - обично Мг2+ за активност. Неке полимеразе ће такође радити, иако мање ефикасно са пуферима који садрже Мн2+. Калцијумови јони су прилично неефикасни. Пошто дНТП и олигонуклеотиди везују Мг2+, моларна концентрација катјона мора бити већа од моларне концентрације фосфатних група које доприносе дНТП и прајмери. Стога је немогуће препоручити концентрацију Мг2+ која је опциона у свим околностима. Иако се рутински користи концентрација од 1,5 мМ Мг2+, пријављено је да повећање концентрације Мг2+ на 4,5 мМ или 6 мМ смањује неспецифично прајминг у неким случајевима, а повећава га у другим. Оптимална концентрација Мг2+ се стога мора одредити емпиријски за сваку комбинацију прајмера и шаблона. Препарати шаблонске ДНК не би требало да садрже значајну количину хелатних агенаса (попут ЕДТА или негативно наелектрисаних јона као што је ПО43-), који могу да секвестрирају Мг2+.

Трис-Цл, подешен на пХ између 8,3 и 8,8 на собној температури, укључен је у стандардне ПЦР у концентрацији од 10 мМ. Када се инкубира на 72 о Ц (продужна фаза ПЦР), пХ реакционе смеше опада за више од пуне јединице, стварајући пуфер чији је пХ

Стандардни ПЦР пуфер садржи 50 мМ КЦл и добро функционише за амплификацију сегмената ДНК дужине &гт500бп. Подизање концентрације КЦл до

70-100 мМ често побољшава принос краћих сегмената ДНК.

Шаблон ДНК који садржи циљне секвенце може се додати у ПЦР у једноланчаном или дволанчаном облику. Затворени кружни ДНК шаблони се умножавају нешто мање ефикасно од линеарних ДНК. Иако величина ДНК шаблона није критична, амплификација секвенци уграђених у ДНК високе молекулске тежине (&гт10кб) може се побољшати варењем шаблона са рестрикцијским ензимом који се не цепа унутар циљне секвенце.

Када ради на најбољи могући начин, ПЦР захтева само једну копију циљне секвенце као шаблон. Типичније, међутим, неколико хиљада копија циљне ДНК се засеје у реакцију. У случају геномске ДНК сисара, по реакцији се користи до 1 μг ДНК, количина која садржи

3*105 копија аутозомног гена у једној копији. Типичне количине ДНК квасца, бактерија и плазмида које се користе по реакцији су 10 μг, 1 μг и 1 пг.


Избор ПЦР Мастер Микса

Коришћење ПЦР мастер мешавине за ПЦР експерименте у реалном времену обезбеђује брже подешавање са мање пипетирања, смањењем контаминације, мањом варијабилности од епрувете до епрувете и поновљивијим резултатима.

Био-Рад ПЦР мастер мешавине су оптимизоване за различите примене, на пример, квантификацију експресије гена, генотипизацију или анализу топљења високе резолуције. Постоји низ разматрања при избору најбоље ПЦР мастер мешавине за вашу апликацију укључујући:

  • Тип ПЦР &мдасх скрининг, клонирање или квантитативно
  • Величина ампликона
  • Сложеност шаблона и Г-Ц садржај, секундарна структура итд.
  • Брзина, верност и процесност ДНК полимеразе
  • Толеранција инхибитора
  • Хот-старт полимераза посредована антителом
  • Толеранција на параметре реакције као што су различити прајмери ​​Тм вредности
  • Прилагодљивост
  • Цена по реакцији

Опције дииБио Тхермоцицлер

Постоји неколико опција које су доступне диибио људима који желе да изврше ПЦР реакције код куће. Имајући на уму да сви термоциклери заиста загревају и хладе узорке ДНК током низа циклуса, разлика у опцијама се своди на цену, величину и степен аутоматизације.

Ево неких од опција.

МиниПЦР мини8

ПоцкетПЦР

БентоЛаб

тамо био такође ОпенПЦР, али изгледа да је пројекат прекинут и замењен кПЦР машином која почиње од око 5000 долара. Ја ћу то прескочити јер је то ван домета за већину дии биолога.

Дакле, који сам термоциклер на крају изабрао?

Одвагао сам све опције и кренуо у другом правцу: куповина половних термоциклера на еБаиу!

Куповина на еБаиу је сама по себи ризична, али се може учинити. Апсолутно морате бити сигурни да је на листи наведено да је јединица тестирана и да ради. Апсолутно морате да се уверите да долази са топлотним блоком (велики комад метала у који се налазе цеви) у супротном, куповина новог блока може коштати више од саме машине.

Чуо сам да неки људи имају среће са поправком покварених јединица, али не бих препоручио овај приступ ако сте нови у диибио-у јер ћете већ бити преоптерећени стварима које треба радити и научити.

На крају сам купио Апплиед Биосистемс ГенеАмп ПЦР 9700 за око 300 УСД (150 УСД за јединицу + 150 УСД за испоруку).

Ова опција је за мене била најјефтинија од свих горе наведених опција, чак и са високим трошковима доставе. Иако није преносив и не може се контролисати путем апликације, функционише. Има топлотни блок са 96 бунара што је више него што ће ми икада требати за моју кућну лабораторију. Омогућава ми да лако програмирам и чувам своје ПЦР рутине. И изненађујуће, многе од једнократних и периферних уређаја још увек продаје ТхермоФисхер.

Поглед одозго на термоциклер у испорученој амбалажи Поглед на дисплеј термоциклера

Додатне компоненте неопходне за покретање ПЦР-а

Термоциклер је само један део слагалице у појачавању ДНК. Постоје и друге процедуре и потребни алати + реагенси који ће вам бити потребни да бисте успешно покренули ПЦР реакцију.

Моје искуство је у екстракцији и појачавању ИТС гена из узорака гљивица, али исти општи захтеви ће бити потребни за било који ген(е) које желите да појачате:

  • Екстракција ДНК – требаће вам узорак, протокол за екстракцију ДНК, реагенси за разбијање ДНК из ћелија ваших култура’, центрифуга и Епендорф епрувете од 1,5 мл или 0,2 мл.
  • Олигонуклеотиди (прајмери) прајмери ​​су мали ланци ДНК који имају префикс и суфикс гена које желите да појачате. Када издвојите своју ДНК, умешаћете прајмере према вашем протоколу пре покретања ПЦР-а. Током ПЦР-а, прајмери ​​ће се везати за ген од интереса, где ће следећи реагенс у наставку радити да удвостручи ген од интереса.
  • ТАК Полимерасе – овај реагенс је додат са прајмерима и то је посебан ензим отпоран на топлоту који олакшава удвостручавање гена од интереса између сваког циклуса денатурације/жарења.
  • Буффер – пуфер је обично само вода и Трис-ХЦЛ пХ 8.0 (понекад са ЕДТА), али његова улога је да балансира и стабилизује екстраховану ДНК и/или ствара разблажења прајмера.

Након извођења ПЦР-а, гел електрофореза се може користити за тестирање да ли је ваша ПЦР реакција била успешна или не. Ово је важан корак јер осигурава да сте појачали исправан ген пре него што наставите са скупим следећим корацима као што је секвенцирање.

На крају, рећи ћу да је учење ПЦР-а невероватно користан и свестран алат. Многи људи са којима сам разговарао размишљају о свом времену проведеном у учењу и раду са ПЦР реакцијама. Велики део савременог генетског рада не би био могућ без ПЦР-а. Зато идите и научите то! Биће вредно вашег времена.


КПЦР и РТ-кПЦР

Квантитативни ПЦР крајње тачке

ПЦР и РТ-ПЦР се генерално користе у квалитативном формату за процену биолошких узорака. Међутим, широк спектар примена, као што је одређивање вирусног оптерећења, мерење одговора на терапеутске агенсе и карактеризација експресије гена, би се побољшао квантитативним одређивањем циљаног обиља. Теоретски, ово би требало бити лако постићи, с обзиром на експоненцијалну природу ПЦР-а, јер постоји линеарна веза између броја циклуса амплификације и логаритма броја молекула. У пракси, међутим, ефикасност амплификације је смањена због контаминаната (инхибитора), компетитивних реакција, исцрпљености супстрата, инактивације полимеразе и циљаног поновног жарења. Како се број циклуса повећава, ефикасност амплификације се смањује, што на крају доводи до ефекта платоа.

Нормално, квантитативни ПЦР захтева да се мерења изврше пре фазе платоа, тако да однос између броја циклуса и молекула буде релативно линеаран. Ова тачка мора бити одређена емпиријски за различите реакције због бројних фактора који могу утицати на ефикасност амплификације. Пошто се мерење врши пре реакционог платоа, квантитативни ПЦР користи мање циклуса амплификације него основни ПЦР. Ово може узроковати проблеме у откривању коначног производа јер има мање производа за откривање.

За праћење ефикасности амплификације, многе апликације су дизајниране да укључе интерни стандард у ПЦР. Један такав приступ укључује други пар прајмера који је специфичан за ген &лдкуохоусекеепинг&рдкуо (тј., ген који има константан ниво експресије међу упоређеним узорцима) у реакцији (Гаудетте и Цраин, 1991. Мурпхи ет ал. 1990). Амплификација кућних гена потврђује да су циљна нуклеинска киселина и компоненте реакције биле прихватљивог квалитета, али не узима у обзир разлике у ефикасности амплификације због разлика у величини производа или ефикасности жарења прајмера између интерног стандарда и циља који се квантификује.

Концепт компетитивне ПЦР&мдасха варијације квантитативног ПЦР&мдасхи је одговор на ово ограничење. У компетитивном ПЦР-у, реакција се додаје позната количина контролног шаблона. Овај шаблон је амплификован коришћењем истог пара прајмера као и експериментални циљни молекул, али даје препознатљив производ (нпр. различита величина, рестриктивни образац дигестије, итд.). Количине контролног и тест производа су упоређене након амплификације. Док ови приступи контролишу квалитет циљне нуклеинске киселине, компоненти пуфера и ефикасност жарења прајмера, они имају своја ограничења (Сиеберт и Ларрицк, 1993 МцЦуллоцх ет ал. 1995), укључујући и чињеницу да многи зависе од коначне анализе електрофорезом.

Постоје бројни тестови флуоресцентне и чврсте фазе за мерење количине производа амплификације који се генерише у свакој реакцији, али они често не успевају да разликују амплификовану ДНК од интереса од неспецифичних производа амплификације. Неке од ових анализа се ослањају на технике упијања, које уводе још једну варијаблу због ефикасности преноса нуклеинске киселине, док су други тестови развијени да елиминишу потребу за гел електрофорезом, а дају потребну специфичност. ПЦР у реалном времену, који пружа могућност прегледа резултата сваког циклуса амплификације, је популаран начин да се превазиђе потреба за анализом електрофорезом.

Квантитативни ПЦР у реалном времену

Употреба флуоресцентно обележених олигонуклеотидних сонди или прајмера или флуоресцентних ДНК-везујућих боја за детекцију и квантитацију ПЦР производа омогућава да се квантитативни ПЦР изврши у реалном времену. Посебно дизајнирани инструменти изводе и термичке циклусе да појачају циљ и детекцију флуоресценције за праћење акумулације ПЦР производа. Боје које везују ДНК су једноставне за употребу, али не праве разлику између специфичних и неспецифичних ПЦР производа и нису погодне за мултиплексне реакције. Флуоресцентно обележене сонде нуклеинске киселине имају предност у томе што реагују само са специфичним ПЦР производима, али могу бити скупе и тешке за дизајн. Неке кПЦР технологије користе флуоресцентно обележене ПЦР прајмере уместо сонди.

Употреба флуоресцентних боја које везују ДНК је један од најлакших кПЦР приступа. Боја се једноставно додаје у реакцију, а флуоресценција се мери у сваком ПЦР циклусу. Пошто се флуоресценција ових боја драматично повећава у присуству дволанчане ДНК, синтеза ДНК се може пратити као повећање флуоресцентног сигнала. Међутим, прелиминарни рад се често мора обавити како би се осигурало да ПЦР услови дају само одређени производ. У наредним реакцијама, специфично појачање се може потврдити анализом криве топљења. Термичке криве топљења се генеришу тако што се дозвољава да сви производи формирају дволанчану ДНК на нижој температури (приближно 60°Ц) и полако повећавају температуру до нивоа денатурације (приближно 95°Ц). Дужина и редослед производа утичу на температуру топљења (Тм), тако да се крива топљења користи за карактеризацију хомогености ампликона. Неспецифична амплификација се може идентификовати по широким пиковима на кривој топљења или пиковима са неочекиваним вредностима Тм. Разликовањем специфичних и неспецифичних производа амплификације, крива топљења додаје аспект контроле квалитета током рутинске употребе. Генерисање кривуља топљења није могуће са тестовима који се ослањају на 5&приме&рарр3&приме егзонуклеазну активност Так ДНК полимеразе, као што је ТакМан&рег технологија заснована на сонди.

Неке кПЦР стратегије користе комплементарне сонде нуклеинске киселине за квантификацију ДНК циља. Ове сонде се такође могу користити за откривање полиморфизама појединачних нуклеотида (Лее ет ал. 1993 Бернард ет ал. 1998). Постоји неколико општих категорија ПЦР сонди у реалном времену, укључујући сонде за хидролизу, укосницу и једноставне хибридизационе сонде. Ове сонде садрже комплементарну секвенцу која омогућава сонди да се жари са нагомиланим ПЦР производом, али сонде се могу разликовати по броју и локацији флуоресцентних репортера.

Сонде за хидролизу су обележене флуором на 5&приме-крају и гаситељем на 3&приме-крају, а пошто су два репортера у непосредној близини, флуоресцентни сигнал се гаси. Током корака жарења, сонда се хибридизује са ПЦР производом генерисаним у претходним циклусима амплификације. Добијени хибрид сонда:циљ је супстрат за активност 5&приме&рарр3&приме егзонуклеазе ДНК полимеразе, која разграђује жарену сонду и ослобађа флуор (Холланд ет ал. 1991). Флуор се ослобађа од ефеката гаситеља који апсорбује енергију, а напредак реакције и акумулација ПЦР производа се прати повећањем флуоресценције. Са овим приступом, прелиминарни експерименти морају бити изведени пре квантитационих експеримената да би се показало да је генерисани сигнал пропорционалан количини жељеног ПЦР производа и да не долази до неспецифичне амплификације.

Сонде за укосницу, такође познате као молекуларни беацонс, садрже обрнуте понављања одвојене секвенцом комплементарном циљној ДНК. Понављано жарење да би се формирала структура укоснице, где су флуор на 5&приме-крају и гаситељ на 3&приме-крају у непосредној близини, што резултира малим флуоресцентним сигналом. Сонда за укосницу је дизајнирана тако да се сонда првенствено везује за циљну ДНК, а не да задржи структуру укоснице. Како реакција напредује, све веће количине сонде се жаре до нагомиланог ПЦР производа, и као резултат, флуор и гаситељ постају физички одвојени. Флуор се више не гаси, а ниво флуоресценције се повећава. Једна од предности ове технике је та што је мања вероватноћа да се сонде за укоснице не подударају него сонде за хидролизу (Тиаги ет ал. 1998). Међутим, морају се извршити прелиминарни експерименти да би се показало да је сигнал специфичан за жељени ПЦР производ и да не долази до неспецифичне амплификације.

Употреба једноставних хибридизационих сонди укључује две обележене сонде или, алтернативно, једну обележену сонду и обележени ПЦР прајмер. У првом приступу, енергију коју емитује флуор на једној сонди апсорбује флуор на другој сонди, која хибридизује у близини. У другом приступу, емитована енергија се апсорбује од стране другог флуора који је уграђен у ПЦР производ као део прајмера. Оба ова приступа резултирају повећаном флуоресценцијом акцептора енергије и смањеном флуоресценцијом донора енергије. Употреба хибридизационих сонди може се још више поједноставити тако да је потребна само једна обележена сонда. У овом приступу, гашење флуора деоксигуанозином се користи да би се дошло до промене флуоресценције (Цроцкетт и Виттвер, 2001 Курата ет ал. 2001). Обележена сонда се жари тако да је флуор у непосредној близини Г остатака унутар циљне секвенце, а како се жарење сонде повећава, флуоресценција се смањује услед гашења деоксигуанозина. Овим приступом, локација сонде је ограничена јер сонда мора да се хибридизује тако да флуоресцентна боја буде веома близу Г остатка. Предност једноставних хибридизационих сонди је њихова способност да се лакше мултиплексирају од хидролизних и укосних сонди кроз употребу различито обојених флуора и сонди са различитим температурама топљења (прегледано у Виттверу ет ал. 2001).

Неке кПЦР стратегије користе комплементарне сонде нуклеинске киселине за квантификацију ДНК циља. Ове сонде се такође могу користити за откривање полиморфизама појединачних нуклеотида (Лее ет ал . 1993 Бернард ет ал . 1998). Постоји неколико општих категорија ПЦР сонди у реалном времену, укључујући сонде за хидролизу, укосницу и једноставне хибридизационе сонде. Ове сонде садрже комплементарну секвенцу која омогућава сонди да се жари са нагомиланим ПЦР производом, али сонде се могу разликовати по броју и локацији флуоресцентних репортера.

КПЦР производи и ресурси

ГоТак&рег кПЦР и РТ-кПЦР комплети су доступни за ПЦР приступе у реалном времену на бази боје или сонде. ГоТак кПЦР системи садрже БРИТ Греен Дие, која обезбеђује максималну ефикасност амплификације и већу флуоресценцију од СИБР Греен.

ГоТак&рег Пробе Системс су мастер мешавине спремне за употребу које поједностављују реакциони склоп за детекцију базирану на сонди хидролизе.


Ин витро мутагенеза

ПЦР мутагенеза кружне ДНК

ПЦР мутагенеза се такође може користити за амплификацију целог плазмида који садржи ген од интереса. Једна директна метода, названа „обрнути“ или „контра“ ПЦР, користи прајмере који се налазе на леђима (слика 2Б), један ПЦР прајмер служи као мутагени олигонуклеотид, а други олигонуклеотидни прајмери ​​из супротног ланца, поред мутагеног прајмера. ПЦР производ је линеарни плазмид пуне дужине који се затим фосфорилише и везује пре трансформације. Овај метод се лако може користити за прављење делеционих мутаната стварањем јаза између прајмера. Варијанте ове методе укључују ПЦР „рекомбинантног круга“ (слика 2Ц) и „рекомбинациони“ ПЦР, од којих се обе ослањају на рекомбинацију линеарних плазмида. У овим техникама, два инверзна ПЦР-а се изводе са прајмерима са празнинама на различитим местима. Ова два мутантна плазмида се затим рекомбинују ин витро мешањем и жарењем (рекомбинантни кружни ПЦР) или ин виво (рекомбинациони ПЦР). Празнине се затим поправљају помоћу машинерије за поправку бактеријске ДНК.


Предност ХД полимеразе мешавине

Адвантаге ХД Полимерасе Мик обезбеђује максималну верност и продужену дужину ПЦР производа, што га чини посебно корисним за апликације које захтевају високу тачност, као што је клонирање цДНК, мутагенеза усмерена на место и генотипизација мутација (тј. СНП анализа).

Адвантаге ХД Полимерасе Мик се састоји од нове ДНК полимеразе са антителом за врући почетак и долази са епруветом 5Кс пуфера (са Мг 2+).

Адвантаге ХД Полимерасе Мик пружа максималну верност и продужену дужину ПЦР производа, што га чини посебно корисним за апликације које захтевају високу прецизност, као што је клонирање цДНК, мутагенеза усмерена на место и генотипизација мутација (тј. СНП анализа).

Адвантаге ХД Полимерасе Мик се састоји од нове ДНК полимеразе са антителом за врући почетак и долази са епруветом 5Кс пуфера (са Мг 2+).

Адвантаге ХД Полимерасе Мик пружа изванредну прецизност због присуства 3' &рарр 5' ексонуклеазне активности која резултира изузетно ниском стопом грешке. Такође ради изузетно добро на ГЦ-богатим и другим сложенијим шаблонима. Адвантаге ХД Полимерасе Мик појачава мете до 8,5 кб од људске геномске ДНК, 10 кб од Е. цоли геномске ДНК и 22 кб од ламбда ДНК. Ефикасност амплификације Адвантаге ХД Полимерасе Мик-а је већа него код дивљег типа Так полимераза.


ПримеСТАР Мак ДНК полимераза—брза и прецизна ПЦР

ПримеСТАР Мак ДНК полимераза има највећу верност и најбржу стопу проширења од било ког Такара Био ензима. Формулација је заснована на Такариној јединственој ПримеСТАР ХС ДНК полимерази високе верности у комбинацији са фактором елонгације да би се обезбедило ефикасно прајминг и продужавање, што у великој мери смањује време потребно за кораке жарења и проширења. Као резултат тога, ПримеСТАР Мак ДНК полимераза се може користити за изузетно брз ПЦР. Формулисан је као 2Кс премикс који садржи оптимизовани пуфер и дНТП, што омогућава брзу припрему реакција за апликације високог протока.

ПримеСТАР Мак ДНК полимераза има највећу верност и најбржу стопу проширења од било ког Такара Био ензима. Формулација је заснована на Такариној јединственој ПримеСТАР ХС ДНК полимерази високе верности у комбинацији са фактором елонгације да би се обезбедило ефикасно прајминг и продужавање, што у великој мери смањује време потребно за кораке жарења и проширења. Као резултат тога, ПримеСТАР Мак ДНК полимераза се може користити за изузетно брз ПЦР. Формулисан је као 2Кс премикс који садржи оптимизовани пуфер и дНТП, што омогућава брзу припрему реакција за апликације високог протока.

Поред тога, стандардизација времена корака продужења чини ПримеСТАР Мак ДНК полимеразу погодном за реакције са вишком нуклеинских киселина које би обично било тешко појачати због неспецифичног везивања. Врхунска процесност ПримеСТАР Мак ДНК полимеразе спречава инхибицију прекомерним нуклеинским киселинама, што резултира много већом стопом успеха за ПЦР са минималном потребном оптимизацијом. Функција врућег покретања посредована антителом обезбеђује побољшану специфичност спречавањем лажних догађаја иницијације током реакционог склопа.


Погледајте видео: 5-я студия. Положительный ПЦР-тест не означает, что человек болен и заразен: эксперт о коронавирусе (Август 2022).