Информације

Помозите у анализи СДС-Паге гела

Помозите у анализи СДС-Паге гела



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

У овом експерименту, трансформисали смо скраћење секвенце НФАТ протеина у плазмидни вектор који ће бити експримиран у Е.Цоли као фузиони протеин са ГСТ. Такође смо покушали да трансформишемо нормални плазмид без НФАТ-а како бисмо могли да добијемо само ГСТ. Након одрастања ових колонија и одабира позитивних колонија, лизирали смо е.цоли. Сакупили смо нешто од овог лизата за СДС-ПАГЕ. Затим смо ставили лизиране ГСТ и ГСТ-НФАТ растворе у одвојене колоне са куглицама глутатиона. ГСТ везује глутатион. Опрали смо колону и сакупили нешто од испирања за СДС-ПАГЕ. Коначно, елуирали смо ГСТ и ГСТ-НФАТ са колоне и сачували нешто за СДС-ПАГЕ.

Приложио сам слику успешне верзије СДС-ПАГЕ.

Желите да усмерите своју пажњу на прву траку, маркер молекуларне тежине (МВМ). Остатак трака треба тумачити у сетовима од 3. Прва од три је сирови лизат, друга од три је прво прање, а последња је елуирани протеин од интереса. Важне траке за моју анализу су 8-10 и 11-13.

Објаснићу шта знам од овог СДС-ПАГЕ гела до сада. Знам тежине различитих трака у маркеру молекулске тежине јер сам добио копију различитих протеина у маркеру. Из ових информација, успео сам да потврдим да сам изоловао свој протеин од интереса у стази 13 и изоловао сам ГСТ у стази 10. Такође разумем разлог зашто су стазе лизата најтамније, праћене тракама за прање, а затим веома чисте протеинске траке од интереса. Такође, имајте на уму да су маркер и траке за елуирање напуњене са 10 микролитара, док су друге траке биле по 2 микролитра. Међутим, постоје неке ствари које не разумем из гела.
(1) Зашто су траке тако дифузне/ниске резолуције. Претпостављам да је то можда преоптерећење бунара, али нисам убеђен јер сам следио утврђену процедуру.
(2) Зашто постоје велике количине пруга, посебно у тракама 5, 8, 9, 10 и 11.
(3) Изоловао сам свој протеин од интереса јер је то био фузиони протеин са ГСТ-ом (или само ГСТ), а затим сам елуирао протеин са куглица глутатиона преко испирања вишка глутатиона. Теоретски, траке за елуирање треба да буду ослобођене свега осим протеина од интереса и глутатиона. Ово углавном важи за траке 4 и 9, које би требало да имају само ГСТ и глутатион. Међутим, траке 7 и 13 треба да имају само ГСТ-НФАТ и глутатион. Међутим, траке нису тако јасне и изгледа да су обојене бројне друге протеине. Шта се догађа?
(4) Професор ми је рекао да је друга трака у стази 13 (трака ГСТ-НФАТ) производ деградације. Како то може бити? Опсег не одговара тежини самог НФАТ-а или само ГСТ-а. Такође, ако је НФАТ-ГСТ деградиран, зар не би постојала два опсега производа деградације?
(5) Зашто само ГСТ траке имају оно што изгледа као дупле траке? (траке 4, 10).
(6) Ако смо протеине од интереса елуирали вишком глутатиона, који има веома ниску молекуларну тежину, зашто се не појављује на гелу? Да ли је могуће да је побегао пре свега?
(7) Имам листу тежина трака молекуларног маркера. Ипак, на дну постоји додатни појас који се не појављује на мојој листи. Да ли је могуће да је моја листа непотпуна или се нешто друго дешава?

На крају, приложио сам слику неуспелог СДС-ПАГЕ гела.

Једина ствар за коју дефинитивно знам да је извор грешке је чињеница да је мој ниво бафера пао током рада (због цурења). Резултати овог гела су тачни (траке 2-7 одговарају стазама 8-13 на горњем гелу, а резултати су скоро идентични), али је гел испао ужасно. Како пад бафера може изазвати овај резултат? Или постоји нешто друго што је можда допринело овом чудном обрасцу? Коначно, траке нису толико различите у овом гелу као у првом гелу, али је коришћен исти чешаљ, а самим тим и иста величина и размакнути бунари. Зашто је онда било толико крварења између трака/недостатак простора између трака?

Хвала унапред на било каквој помоћи.


Ево неколико мисли заснованих на мом искуству пречишћавања многих протеина и покретања многих СДС-ПАГЕ гелова:

(1) Резолуција - колико брзо сте покренули овај гел? Често ако радите на више од рецимо 150В или тако, можете добити бендове који изгледају овако. Резолуција би такође могла да се односи на…

(2) Кладим се да је пругање последица соли у узорку – много времена пуфери за лизу/испирање/елуирање могу да имају више од 500 мМ или 1 М соли, а то увек изазива пругање. Ставите мање узорака у ове траке и одржите укупну запремину истом да би се со разблажила испод 250 мМ најмање. Друге ствари у вашим пуферима могу узроковати пругање, али сол је најчешћа (обавијестите нас о саставу ваших пуфера за лизу/испирање/елуирање).

(3) Само ваше пречишћавање ГСТ-а изгледа веома добро – често ће ваше припреме много више личити на траке које сте навели, а које нису сасвим чисте. Ово је прилично уобичајено за пречишћавање у једном кораку - често су вам потребна 2-3 да би одређени протеини у потпуности уклонили загађиваче. Постоји неколико могућих извора ових бендова:

  1. Ендогени протеини: Многи бактеријски протеини ће се неспецифично залепити за перле (због тога перемо), али чак и темељно прање и даље може оставити неке загађиваче. Ови протеини такође могу бити везани за протеин који вас занима и коелуирају се са смоле.
  2. Производи за скраћивање: У зависности од тога где се налази ваша ознака (наставимо да је на Н-крају), понекад можете добити некомплетне производе за превођење – они имају ознаку, али нису протеини пуне дужине. Оне ће се и даље везати и елуирати из перли јер су задржале ознаку. Занемарите ову тачку ако се ознака налази на Ц-терминусу, јер ће у том случају ознака бити само на протеину пуне дужине.
  3. Производи разградње: Ово се односи на ваша каснија питања - често ће током пречишћавања ваш протеин бити разграђен бактеријским протеазама. Да ли сте укључили разне инхибиторе протеазе у свој пуфер за лизу? Чување свих ваших узорака на леду је такође важно из овог разлога.

(4) Схватите да производи разградње не значе да добијате само свој протеин и фузионисани ГСТ – они могу бити различита скраћења услед деградације протеазама.

(5) Кладим се да је то само због ваших услова рада или соли у вашим узорцима. Мислим да је ово вероватно ваш појединачни ГСТ бенд.

(6) Глутатион се неће појавити на гелу – његова формула је око 300 г/мол ако се сећам, што значи да је око 300 далтона, што је много мање од било чега што ћете задржати на гелу. Даље, запамтите да је ваша мрља за протеине - Цоомассие плава везује основне остатке на протеинима.

(7) Нисам сигуран на коју траку мислите, али мислим да је доња трака у вашој траци за обележавање једноставно предња страна боје. То такође може бити производ разградње протеина у вашој лествици.

Што се другог гела тиче - све је то због пада нивоа пуфера током трчања. Без пуфера који покрива врх гела нема струје. Вероватно сте, пошто је дошло до цурења, имали неравномерну дистрибуцију бафера. Чудне ствари се могу догодити када се то догоди (ненаучно, знам).


Натријум додецил сулфат облаже протеине пропорционално њиховој молекулској тежини, а затим даје исти негативни електрични набој на све протеине у узорку. Брзина миграције полипептида у СДС-ПАГЕ је обрнуто пропорционална логаритму његове молекулске тежине. То значи да што је полипептид већи, спорије мигрира у гелу. Молекуларна тежина се одређује упоређивањем миграције протеинских мрља са миграцијом стандарда. Графикони лог молекулске тежине у односу на растојање миграције су прилично линеарни.

Протеини раздвојени помоћу СДС-ПАГЕ се често враћају у процедури која укључује локализацију протеина од интереса на гелу након СДС-ПАГЕ, елуирање протеина из гела, уклањање натријум додецил сулфата из елуираног узорка и коначно ренатурисање протеина за накнадну анализу. Протеини који се елуирају из гелова се успешно користе у различитим низводним применама, као што су хемија протеина, одређивање састава аминокиселина, идентификација полипептида који одговарају специфичној ензимској активности и друге сврхе.

Анализа концентрација протеина је значајан тест у биохемијским истраживањима. Брадфордов тест је једна од најчешће коришћених метода за одређивање концентрације протеина у односу на стандард. Техника се заснива на формирању комплекса између протеина у раствору и боје. Овај тест је похваљен за свеукупну употребу, посебно за процену концентрација протеина за гел електрофорезу. Протеини одвојени помоћу СДС-ПАГЕ често се добијају у поступку који укључује локализацију протеина од интереса на гелу након СДС-ПАГЕ, елуирањем протеина из гела, уклањањем натријум додецил сулфата из елуираног узорка и коначно ренатурисањем протеина за накнадну анализу.

Протеини који се елуирају из гелова се успешно користе у различитим низводним применама, као што су хемија протеина, одређивање састава аминокиселина, идентификација полипептида који одговарају специфичној ензимској активности и друге сврхе. Анализа концентрација протеина је значајан тест у биохемијским истраживањима. Брадфордов тест је један од најчешће коришћених метода за одређивање концентрације протеина у односу на стандард. Техника се заснива на формирању комплекса између протеина у раствору и боје, Бриллиант Блуе Г.

Овај тест је похваљен за општу употребу, посебно за процену концентрација протеина за гел електрофорезу. Заснован је на запажањима да максимум апсорпције за киселе мешавине Цоомассие Бриллиант Блуе Г-250 које се померају са 465 нм на 595 нм у време када се јавља везивање протеина. Тест је ефикасан зато што је коефицијент екстерминације раствора комплекса албумин-боја обично константан у опсегу од 10-струке концентрације (Вестермеиер, Навен & Хо?пкер, 2008).

Боја реагује углавном са остацима аргинина, али мање са остацима хистидина, лизина, триптофана, тирозина и фенилаланина. Чини се да ово испитивање није баш савршено за киселе или базичне протеине. Међутим, донекле је осетљив на албумин говеђег серума, чак и више од већине протеина, за фактор два. Гама глобулин (ИгГ) је протеински стандард преференције. Циљ овога


Садржај

СДС-ПАГЕ је метода електрофорезе која омогућава раздвајање протеина по маси. Медијум (који се такође назива 'матрица') је дисконтинуални гел на бази полиакриламида. Поред тога, користи се СДС (натријум додецил сулфат). Око 1,4 грама СДС се везује за грам протеина, Α] Β] Γ] што одговара једном СДС молекулу на две аминокиселине. СДС делује као сурфактант, маскирајући унутрашњи набој протеина и дајући им веома сличне односе наелектрисања и масе. Интринзична наелектрисања протеина су занемарљива у поређењу са СДС пуњењем, а позитивна наелектрисања су такође значајно смањена у основном пХ опсегу гела за раздвајање. Након примене константног електричног поља, протеин мигрира ка аноди, сваки са различитом брзином, у зависности од своје масе. Ова једноставна процедура омогућава прецизно одвајање протеина по маси.

СДС има тенденцију да формира сферичне мицеле у воденим растворима изнад одређене концентрације која се назива критична мицеларна концентрација (ЦМЦ). Изнад критичне мицеларне концентрације од 7 до 10 милимола у растворима, СДС се истовремено јавља као појединачни молекули (мономер) и као мицеле, испод ЦМЦ СДС се јавља само као мономери у воденим растворима. При критичној мицеларној концентрацији, мицела се састоји од око 62 СДС молекула. Δ] Међутим, само СДС мономери се везују за протеине путем хидрофобних интеракција, док су СДС мицеле споља ањонске и не адсорбују никакав протеин. Α] СДС је амфипатске природе, што му омогућава да развија и поларне и неполарне делове структуре протеина. Ε] У концентрацијама СДС изнад 0,1 милимола, почиње одвијање протеина, Α] и изнад 1 мМ већина протеина је денатурисана. Α] Због снажног денатурирајућег ефекта СДС-а и накнадне дисоцијације протеинских комплекса, кватернарне структуре се генерално не могу одредити са СДС-ом. Изузеци су протеини који су стабилизовани ковалентним умрежавањем нпр. -С-С- везе и протеински комплекси отпорни на СДС, који су стабилни чак иу присуству СДС-а (међутим, само на собној температури). За денатурацију комплекса отпорних на СДС потребна је висока енергија активације, која се постиже загревањем. Отпорност на СДС је заснована на метастабилности протеинског набора. Иако природни, потпуно савијени протеин отпоран на СДС нема довољну стабилност у присуству СДС, хемијска равнотежа денатурације на собној температури се јавља споро. Стабилне протеинске комплексе карактерише не само отпорност на СДС, већ и стабилност на протеазе и продужени биолошки полуживот. Ζ]

Алтернативно, електрофореза у полиакриламидном гелу се такође може извести са катјонским сурфактантима ЦТАБ у ЦТАБ-ПАГЕ, Η] ⎖] ⎗] или 16-БАЦ у БАЦ-ПАГЕ. ⎘]


16.6: Микро-извештај 5- СДС-ПАГЕ и Вестерн блот анализа

  • Донео Цларе М. О&рскуоЦоннор
  • Ванредни професор емеритус (биологија) на Бостонском колеџу

У овом извештају ћете описати резултате СДС-ПАГЕ и вестерн блотова које сте користили да анализирате експресију протеина у вашим трансформисаним ћелијама и под потиснутим и у индукованим условима. Обратите посебну пажњу на степен у којем ови резултати потврђују или су у супротности са резултатима претходног извештаја о трансформацији/комплементацији. Фигура треба да буде означена на такав начин да искусни научник може да разуме ваше резултате само из фигуре и легенде. Многи експериментални детаљи су пребачени у одељак М&ампМ. Траке треба да буду јасно означене и молекуларне тежине стандарда треба да буду укључене. (Пример у наставку је из другог разреда, где су ученици користили СДС-ПАГЕ и вестерн блотове да анализирају прекомерну експресију протеина квасца изражених из пБГ1805. Имајте на уму да је, за разлику од ваших експеримената, примарно антитело на ХА епитоп коришћено за откривање протеина на вестерн мрље.)

Материјали и методе: Обезбедите информације о трансформисаним сојевима, условима инкубације, припреми ћелијских екстраката, СДС-ПАГЕ геловима и вестерн блотовима. Реферирајте објављене процедуре када је то могуће, уз напомену да постоје модификације. Поднаслови могу бити од помоћи.

Трансформисани сојеви: Укључите називе сојева и плазмида које сте користили за припрему ћелијских екстраката.

Екстракти: Укључите информације о медијумима и временима инкубације који се користе за манипулацију прекомерне експресије протеина из сојева. Погледајте приручник за процедуру екстракције, уз напомену да постоје модификације.

СДС-ПАГЕ гелови: Наведите детаље о % акриламида у геловима, времену рада и напону који се користи за електрофорезу.

Електрофоретски трансфер: Укључите време и напон који се користе за пренос протеина са СДС-ПАГЕ гела на ПВДФ мембрану. За остале детаље погледајте упутство.

Вестерн блот: Укључите антитела која сте користили за мрљу и услове (време, температура) које сте користили за сваку од инкубација. Укључите време које сте користили за откривање прекомерно експримираних протеина са ТМБ. (Ово даје известан осећај о обиљу протеина у вашим екстрактима.) НЕ морате укључити све кораке прања - само погледајте упутство.

Резултати и дискусија - Започните разговором о СДС-ПАГЕ гел. СДС-ПАГЕ гел даје снимак ћелијских протеина и грубо поређење концентрација протеина у различитим екстрактима. Интензитет бојења траке одражава њено обиље у екстракту.

  • Како се упоредила укупна количина протеина између индукованих и неиндукованих узорака? (Шта би то могло указивати на различите изворе угљеника?)
  • Да ли сте видели промене на појединим тракама на гелу? Да ли је могуће открити фузиони протеин на позадини других протеина у екстракту? Подсетимо се да ћелије имају хиљаде протеина и да се трака може састојати од више од једне врсте протеина.

Тхе вестерн блот омогућава вам да откријете фузиони протеин на позадини других ћелијских протеина. Укључите табелу која приказује предвиђене и стварне величине Мет или ЛацЗ протеина откривених применом вестерн блот технике. Величине протеина су посебно важне. (Вероватно није могуће добити тачну вредност величине протеина, због нејасних стандарда на вестерн блотовима. Без обзира на то, требало би да будете у могућности да поставите протеине унутар одређеног опсега.) Протеини кодирани плазмидом ће бити већи од природног протеина због ознака епитопа које кодира плазмид. Да ли су посматране величине оно што сте очекивали?


Анализа чистоће СДС-ПАГЕ

Електрофореза у полиакриламидном гелу натријум додецил сулфата (СДС-ПАГЕ) је технологија која се обично користи у пречишћавању и анализи протеина. СДС-ПАГЕ може да одвоји протеине према разликама у наелектрисању и различитој покретљивости због различитих величина молекула. Ако је узорак протеина високо пречишћен и садржи само један протеин, резултати би показали једну траку протеина након одвајања СДС-ПАГЕ. Међутим, када постоји више протеина у узорцима протеина, различити протеини се могу раздвојити у више протеинских трака путем СДС-ПАГЕ. Стога, СДС-ПАГЕ технологија пружа директан начин за анализу чистоће узорака протеина. Да би се задовољиле истраживачке потребе анализе чистоће протеинских производа, МтоЗ Биолабс је развио и оптимизовао радни ток заснован на СДС-ПАГЕ-у и пружа прецизну аналитичку услугу за проучавање пречишћавања протеина/пептида.

Аналитички принципи СДС-ПАГЕ

СДС је врста ањонског сурфактанта који може да разбије водоничне и хидрофобне везе у протеинима. СДС се може везати за протеине у одређеној пропорцији и формирати комплексе СДС-протеина, који покривају унутрашње наелектрисање протеина. Стога је брзина миграције свих врста СДС-протеинских комплекса одређена само молекулском тежином протеина. Различити протеини се раздвајају СДС-ПАГЕ електрофорезом, након чега следи бојење протеина и анализа протеинских трака.

СДС-ПАГЕ Аналитички радни ток

СДС-ПАГЕ аналитичке процедуре:

1. Одређивање концентрације протеина
2. Припрема узорка: додати 2к пуфер за пуњење (5% β-МЕ) и кувати узорак 10 минута
3. Електрофоретска припрема: производња гела, уградња електрофоретског резервоара и припрема електрофоретског пуфера
4. Пуњење узорака протеина: према концентрацији протеина, узети одговарајућу количину обрађених узорака протеина и додати у џеп гела. Након пуњења свих узорака, додајте протеински стандардни маркер у први или последњи џеп гела.
5. Електрофореза: укључите напајање, подесите напон на 100В и ставите гел на константан напон.
6. Бојење гелом: На крају електрофоретског одвајања, бојење Р250 бојом у трајању од 1 сата, након чега следи одбојавање протеинског гела док позадина не постане чиста и бистра.
7. Анализа чистоће и молекулске масе узорака протеина

• Експерименталне процедуре
• Параметри СДС-ПАГЕ
• Резултати чистоће протеина
• Биоинформатичка анализа


Лептир и биотехнологија

Здраво, драги читаоци, пријатељи, прошло је доста времена, написао сам овде. Извините због тога, био сам мало заузет у лабораторији! И, можете бити срећни због чињенице да сам био заузет, јер сам добио много искуства да поделим са вама! Почнимо прво са СДС СТРАНИЦОМ!

СДС СТРАНА - Натријум додецил сулфат - Полиакриламид гел електрофореза! Ова СДС ПАГЕ се ради за одвајање протеина на основу њихове молекуларне тежине. То је широко коришћена техника и веома је корисна за добијање идеје о експресији вашег протеина од интереса.

Принцип:
Назив СДС ПАГЕ потиче од чињенице да ова метода користи СДС за стварање равномерног негативног наелектрисања вашег протеина и наравно, гел се припрема коришћењем полиакриламида. Зашто направити протеин негативно наелектрисан? Јер, овде је наш интерес да одвојимо протеине само на основу њихове молекуларне тежине, али не и на основу наелектрисања и сви протеини нису негативно наелектрисани као ДНК (која се одваја на основу величине помоћу електрофорезе Агаросе Гел). СДС је ањонски детерџент и чини ваш протеин негативно наелектрисаном. Због тога се ваш протеин креће ка позитивној електроди. односно анода.

Добро, принцип је у реду, али, које су све могуће грешке које би неко направио док би радио СДС СТРАНИЦУ? Овде ћу објаснити неке могуће грешке, да би то било од помоћи почетницима. Препоручујем вам да научите процедуру за СДС СТРАНИЦУ пре него што ово прочитате.


БИОЛОГИЈА - ТПР/НС

А. Трансфер ДНК између фага и бактерија није се десио одмах након убацивања вируса.

Б. Број 32П је идентификован у генетском материјалу инфициране бактерије корака 3 након бактеријске лизе и ослобађања вириона фага.

Ц. Фрагменти омотача који садрже 35С из потомства фага се адсорбују на бактерије, иако фрагменти не садрже ДНК.

- ДНК је требало да се пренесе у експерименту јер је то генетски материјал. Морамо да докажемо погрешно да је преузето С уместо П.

А. постоји мутација у сегменту ДНК који везује промотер.

Б. мисенс мутација је пронађена у гену који кодира репресор.

Ц. постоји структурни проблем са сегментом ДНК који везује репресор.

А. има геном где скоро сав материјал кодира протеин.

Б. обично користи митозу за ћелијску поделу.

Ц. може да изведе катаболичке реакције да добије енергију из макромолекула.

А. путују даље током СДС-ПАГЕ и брже елуирају током хроматографије са искључењем по величини.

Б. путују даље током СДС-ПАГЕ и елуирају спорије током хроматографије са искључењем по величини.

Ц. путују на мању удаљеност током СДС-ПАГЕ и брже елуирају током хроматографије са искључењем по величини.

СДС-ПАГЕ + дитиотреитол: 3 траке

Које предвиђање о структури ензима је најснажније подржано овим запажањима?

А. Ензим α садржи висок однос наелектрисаних и ненаелектрисаних остатака.

Б. Ензим α садржи више од једне подјединице.

Ц. Ензим α садржи низак однос наелектрисаних и ненаелектрисаних остатака.

Б. низак осмолалитет крви и висок крвни притисак.

Ц. висок осмолалитет крви и низак крвни притисак.

Питање поставља која би физиолошка стања довела до истог одговора као оно што се примећује током конзумирања алкохола

Током ФИСХ-а, флуоресцентно обележене сонде се хибридизују у кластере хромозома.

Ово је слично начину на који се сонде користе у Соутхерн и Нортхерн блотовима.

Сонда мора бити једноланчана ДНК/РНА ако ће се хибридизовати или везати за хромозоме.

А. 25% нормалних са плавим очима, 25% нормалних са смеђим очима, 25% плавих очију са ризиком од Кронове болести и 25% смеђих очију са ризиком од Црохнове болести.

Б. 50% нормално са плавим очима и 50% смеђим очима са ризиком од Кронове болести.

Ц. 50% плавих очију са ризиком од Кронове болести и 50% нормалних са смеђим очима.

А. Догађаји појединачног укрштања резултирају једносмерним измештањем хромозомског садржаја са једног хромозома на други, док догађаји двоструког укрштања увек обрћу ово једносмерно померање, што резултира хромозомима идентичним хромозомима пре укрштања.

Б. Догађаји појединачног укрштања се дешавају током митозе када се ћелија подели на две ћелије, док се догађаји двоструког укрштања могу десити само током мејозе када се ћелија подели на четири ћелије.

Ц. Догађаји појединачног укрштања утичу само на крајеве кракова хромозома, док догађаји двоструког укрштања могу утицати на сегменте у средини кракова хромозома.

А. имају већу вероватноћу да испоље тризомију 21.

Б. имају мању вероватноћу појаве тризомије 21.

Ц. имају сличну вероватноћу да испоље тризомију 21.

А. Трансфер ДНК између фага и бактерија није се десио одмах након убацивања вируса.

Б. Број 32П је идентификован у генетском материјалу инфициране бактерије корака 3 након бактеријске лизе и ослобађања вириона фага.

Ц. Фрагменти омотача који садрже 35С из потомства фага се адсорбују на бактерије, иако фрагменти не садрже ДНК.

А. Нивои ВЕГФ-а >400 пг/мЛ указују на компликације повезане са дијабетесом.

Б. Повишени нивои ВЕГФ узрокују напредовање ПДР-а чак и након хируршког лечења.

Ц. Нивои ВЕГФ &гт400 пг/мЛ су индикативни за ПДР.

А. број колонија примећених само за ЦРЦ157 и ЦРЦ184 трансфектоване са пЦ27-53 би се смањио.

Б. дошло би до смањења броја колонија у свим испитивањима.

Ц. број колонија примећених само за ЦРЦ169 трансфициран са пЦ27-53 и пЦ27-53Кс би се повећао.

А. путују даље током СДС-ПАГЕ и брже елуирају током хроматографије са искључењем по величини.

Б. путују даље током СДС-ПАГЕ и елуирају спорије током хроматографије са искључењем по величини.

Ц. путују на мању удаљеност током СДС-ПАГЕ и брже елуирају током хроматографије са искључењем по величини.

О. Величина узорка је била премала да би се осигурало да су налази статистички значајни.

Б. Вестерн блотови на Слици 4 су изведени 52. недеље, када је телесна тежина Нбеа+/+ мишева и Нбеа+/- мишева постала еквивалентна.

Ц. Патуљасти фенотип Нбеа+/- мишева није успео да се доследно манифестује током времена.

А. Третман ВПА значајно повећава ниво ХЕРВ-В транскрипције у шизофреничним узорцима.

Б. присуство шизофреније или биполарног поремећаја не повећава значајно транскрипцију ХЕРВ-В изнад нормалних нивоа.

Ц. Третман ВПА има значајан утицај на транскрипцију ЕРВ-9.

Овде тражимо изјаву која није подржана приказаним резултатима. Слика 2 приказује значајну разлику између обе групе узорака шизофреније и здраве контроле, што имплицира да шизофренија повећава транскрипцију ЕРВ-9.

А. Експресија ТЕКС11 је неопходна за нормалан структурни развој тестиса.

Б. ТЕКС11 протеин је укључен у постмејотичку фазу сперматогенезе сисара.


ПАГЕ (Полиацриламиде Гел Елецтропхоресис), је аналитичка метода која се користи за раздвајање компоненти протеинске мешавине на основу њихове величине. Техника се заснива на принципу да ће наелектрисани молекул мигрирати у електричном пољу ка електроди супротног предзнака. Опште технике електрофорезе се не могу користити за одређивање молекулске тежине биолошких молекула јер покретљивост супстанце у гелу зависи од и набој и величина. Да би се ово превазишло, биолошке узорке је потребно третирати тако да добију уједначено наелектрисање, тада електрофоретска покретљивост зависи пре свега од величине. За ове различите молекуле протеина са различитим облицима и величинама, потребно је денатурирати (урађено уз помоћ СДС) тако да протеини изгубе своју секундарну, терцијарну или кватернарну структуру. Протеини који су покривени СДС су негативно наелектрисани и када се учитају на гел и стављен у електрично поље, мигрираће према аноди (позитивно наелектрисана електрода) су раздвојени ефектом молекуларног просејавања на основу величине. Након визуелизације техником бојења (специфичне за протеине), величина протеина се може израчунати упоређивањем његове миграционе удаљености са оном познате лествице молекулске тежине (маркера).


Иновације

Минијатуризација

Минијатуризација електрофоретских техника је развијена за ефикасност: максимизирање продуктивности уз минимизирање површине. Ове иновације омогућавају да се експерименти изводе истовремено, као и смањују време и трошкове потребне за извођење ових експеримената [7] . Карактеристика минијатуризације електрофорезе је уградња канала за раздвајање, који раде на повећању ефикасности канала.

Полимери, као што су полидиметилсилоксан (ПДМС) и поли(метил метакрилат) (ПММА) се користе у савременим електрофоретским системима јер се лако могу произвести и робуснији су од стакла. ПММА се посебно користи у гел електрофорези јер не реагује са полиакриламидним геловима. При изради гела у електрофорези се користе различити материјали. На пример, агарозни гел се користи за анализу макромолекула већег обима, посебно већих фрагмената ДНК [8]. Полиакриламид има већу резолуцију од агарозних гелова за анализу мањих узорака, као што су појединачни ланци ДНК или анализа протеина. Поре у ПАГЕ-у су мање и омогућавају већу дискриминацију и раздвајање узорака, са разноврсношћу на микроскали.

Мултидимензионална анализа

Вишеструки тестови за један узорак могу анализирати између 2-4 различите карактеристике и побољшати ефикасност теста [9]. Мултидимензионална анализа користи анализу различитих својстава узорка, као што је комбиновање изоелектричног фокусирања и СДС-ПАГЕ [9], [10] . Изоелектрично фокусирање узорка се одвија хоризонтално и раздваја протеине на основу њихових изоелектричних тачака (приближни пХ где узорци имају нето неутрални набој), успостављајући лествицу узорака на основу пХ градијента. Након тога, СДС-ПАГЕ користи исти гел и покреће га вертикално, даље одвајајући и разликовајући протеине сличних изоелектричних тачака по величини. Мултидимензионална анализа користи различите карактеристике узорака (набој, величина, итд.) како би се свеобухватно одвојили и разликовали узорци (Слика 7).


Закључци

Анализа протеома заснована на 2Д гелу је успешно коришћена за откривање и карактеризацију протеина маркера који су идиотипски за специфично физиолошко или патолошко стање ћелије или ткива. Међутим, сада је очигледно да приступ 2ДЕ-МС&#к0002фМС није погодан за откривање, идентификацију и квантификацију сваког протеина у узорку, задатак који се чини неопходним за свеобухватну анализу и евентуални математички опис биолошких процеса и система. Из тог разлога, неопходно је развити нове технике које омогућавају много веће почетне количине, док истовремено дозвољавају квантитативно поређење експресије протеина великих размера.