Информације

Како оштећење ДНК узрокује старење квасца?

Како оштећење ДНК узрокује старење квасца?



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Колико ја разумем, у старењу квасца постоје ћерка и матична ћелија. Ћерка ћелија има нову "свежу" ДНК и матична ћелија умире након неколико бројања репликације.

Шта се дешава са нагомиланим оштећењем ДНК у матичној ћелији квасца?

Једна од теорија људског старења је нагомилавање оштећења у нуклеарној ДНК. Ћерка ћелија квасца је клон мајке и има исти ДНК. Шта се дешава са овом штетом?

Измените да бисте поједноставили: Зашто се оштећење ДНК уопште не преноси на ћерку ћелију? Механизам поправке код људи очигледно није савршен, јер је оштећење ДНК једна од главних теорија старења. Дакле, ако умремо од овога, како квасац заобилази штетне ефекте оштећења ДНК која изазивају старење код људи?


У еукариотским ћелијама не постоји разлика између ћелије мајке и ћелије ћерке - ова друга је тачна копија ћелије мајке. Ово важи и за квасце, на пример за људске ћелије. Једина ствар која се дешава током времена је да се теломери на крају хромозома скраћу (осим ако ћелија нема активну теломеразу коју већина ћелија нема) и достиже Хејфликову границу где ће свака даља подела довести до недостатка кодирају хромосматске регионе и на тај начин изазивају проблеме. Ако ћелије не задобију никаква друга хромозомска оштећења и имају довољно ресурса, ово би била граница за њихов животни век.

Наравно, постоје оштећења ДНК која се јављају током времена. Већина њих се или поправља високо ефикасним системом за поправку оштећења ДНК еукариотских ћелија, који се састоји од различитих контролних тачака током ћелијског циклуса. Ове контролне тачке се налазе на прелазу између различитих фаза ћелијског циклуса. Ако се идентификује оштећење ДНК, ћелијски циклус се зауставља да би се омогућила поправка оштећења ДНК помоћу специјалних протеина и да би се спречило да оштећене ћелије прођу митозу (овде је контролна тачка Г2-М важна). Ово функционише шематски као на овој слици (из чланка на Википедији о поправци ДНК):

Ако се оштећење ДНК не може решити, ћелије ће или прећи у старење (у суштини ићи у трајно стање мировања) или ће се подвргнути апоптози. Ако постоје оштећења која (из било ког разлога) или нису уочена или се јављају током поправке дволанчаних прекида ДНК нехомологним спајањем крајева, она се затим реплицирају и наслеђују наредним генерацијама. Осим ако се ове грешке не десе током процеса репликације, ћелије мајке и ћерке су генетски идентичне.

Дакле, еукариотске ћелије временом добијају оштећење ДНК (један од разлога зашто касне трудноће представљају већи ризик од раних), али се ми разликујемо од квасца у једној тачки: квасац има активну теломеразу, која није активна у већини наших ћелија ( углавном осим у матичним ћелијама). Ако ћелије сакупе превише хромозомских оштећења, оне ће умрети.

Референце наведене у наставку иду дубље у тему и интересантне су за читање.

Референце:

  1. Негативна регулација активности теломеразе квасца кроз интеракцију са узводним регионом ДНК прајмера
  2. Контрола ћелијског циклуса у бубрезима.
  3. Еволуција различитих биолошких одговора на оштећење ДНК: увиди из квасца и п53
  4. Оштећење ДНК и одлуке: ЦтИП координира поправку ДНК и контролне тачке ћелијског циклуса
  5. Ћелијски одговори на оштећење ДНК: један сигнал, вишеструки избори

Позадина различитих теорија старења.

Овај видео, од вишег предавача на Универзитету у Ливерпулу који је специјализован за старење, говори о теоријама старења. Он се дотиче теорије оштећења ДНК.

Теорија оштећења ДНК старења.

Имајте на уму да када говоримо о теорији оштећења ДНК, конкретно говоримо о оштећењу процеса обнове ћелија механизмом за поправку оштећења ДНК у матичним ћелијама.

Старење мутацијом није исто што и оштећење ДНК које узрокује старење и не може заиста изазвати старење квасца. Идеја да ћелије добијају оштећења током времена због мутиране ДНК је фундаментално другачија од теорије оштећења ДНК старења. Механизми који доводе до оштећења ДНК су веома добро покривени у @Цхрисовом одговору.

Предложени системски ефекат који оштећење ДНК има у људском телу узрокује немогућност обнављања ћелија услед недостатка одрживих матичних ћелија. Ово доприноси процесу старења у организму.

Код квасца, овај процес исцрпљивања матичних ћелија се не дешава (они су углавном једноћелијски). У коментарима се чини да у свом првобитном питању заправо говорите о старењу заснованом на мутацији. Мутације се преносе на ћерке ћелије. Али чини се да ове ћерке ћелије не старе или умиру брже (ако је родитељска ћелија стара 5 дана, изгледа да ћелија ћерке није стара 5 дана). Ово је основни разлог зашто овај облик старења остаје мање проучаван - заправо нема смисла да опште мутације изазивају старење.

Резиме

Да директно одговорим на питање: "Како оштећење ДНК узрокује старење у квасцу?"

Питање не обухвата сасвим целу слику и меша теорију оштећења ДНК старења животиња са општим оштећењем ДНК на ћелијском нивоу.

Постоје многе теорије старења. Нико не зна који од њих у већој или мањој мери утичу на старење. Квасац је добар модел за неке врсте моделирања теорије старости, али можда не у случају старења заснованог на оштећењу ДНК. Иако доживљавају оштећење ДНК у облику мутације, то не узрокује старење на исти начин на који оштећење ДНК може изазвати старење код људи јер су једноћелијски организми и не доживљавају исте међуткивне односе који су сложенији. организми имају.


Измене

Овај одговор је у великој мери измењен од његовог првог нацрта на основу додатних питања и упита из ОП-а у коментарима. Одлучио сам да задржим неке важне тачке које су покренуте и одбачене.

Зашто уопште нема преноса оштећења ДНК на ћерку ћелију?

Може доћи до оштећења ДНК и је пребачен у ћерку ћелију. Ипак, оштећења су веома ретка.

Па како квасац преживљава? Људске матичне ћелије старе и умиру или добијају рак. Али квасац бр. Људи почињу из једне ћелије. И умрети. Квасац почиње из једне ћелије и живи вечно (дели се изнова и изнова)

Измени после коментара:

Једна ћелија

У квасцу нема међуткивних система. Мутирана штета се једноставно преноси ако је ћелија одржива. Такође, претпоставка да они живе заувек није сасвим тачна. Али ДНК се преноси у свом мутираном или оштећеном облику.

Мулти целл

Старење засновано на оштећењу ДНК је велики проблем за животиње. (Доле ет ал 2013) Показали су да оштећење ДНК на једном путу поправке узрокује убрзано старење (али имајте на уму да није дошло до повећања мутације током овог старења).

али ти причаш о раку, то није тако добар пример, моја грешка. Али код људи који старе НЕ као рак – јавља се у СВОМ телу и свим ћелијама. Дакле, у свим ћелијама постоје нека оштећења ДНК.

Друга измена: Имали сте право када сте говорили о раку у овом контексту. Теорија оштећења ДНК старења је да се мале промене (оштећења) у нашој ДНК акумулирају током времена и оштећују типове ћелија тако што оштећују различите путеве поправке ДНК.

Оштећење се акумулира и временом је мање матичних ћелија за обнављање одрживо, а ћелијска поправка других оштећених ћелија се успорава.

Такође, исти основни принцип оштећења мутација које се дешавају током времена може довести до мутација које искључују механизме контроле ћелија и доводе до рака. Иако се ове мутације не повећавају са годинама (Хилл ет ал., 2005).

На пример, голи кртица живи 10 пута више од упоредивих врста (мање старење) и није примећено да природно добија рак (мање рака). Теорија имплицира да су те две ствари прилично повезане због начина на који се ДНК мења, али не и да је специфично мутација узрок или резултат старења.

Више говорим о старењу. Зато што у квасцу постоји старење. И једна од теорија старења за човека - нагомилавање оштећења ДНК. Па шта Цхрис писање је да је то заиста ретко.

**Матичне ћелије су оштећене. ** Више нисам сасвим сигуран шта мислите под старењем у квасцу. Квасац се не ослања на ограничен број матичних ћелија за обнављање ћелија, они не старе на начин на који можда мислите. Они једноставно размножавају мутирану ћелију. Нема утицаја на већи организам као у људском старењу.

Оштећење ДНК. Квасац је организам од велике помоћи за разумевање основне биохемије и генетике старења, а не целокупног система старења. Ово су две различите области студија. Нејасно је о чему говорите у овом тренутку.

Такође постоји старење на местима где нема матичних ћелија - као што је мозак - нема обнављања ћелија, само постојеће ћелије старе, оштећене, умиру и нису замењене.

Долле 2006. је открио да се спонтано оштећење ДНК у односу на године дешава у јетри, али не и у мозгу.


Оксидативни стрес и старење: учење из лекција квасца

квасац Саццхаромицес церевисиае је одиграо виталну улогу у разумевању молекуларне основе старења и односа процеса старења са оксидативним стресом (нехомеостатска акумулација реактивних врста кисеоника, РОС). Антиоксидативни одговори сисара и квасца су слични и преко 25% гена повезаних са дегенеративним болестима код људи има блиске хомологе у квасцу. Смањена генетска редундантност квасца олакшава визуализацију ефекта избрисаног или мутираног гена. Манипулишући условима раста, ћелије квасца могу преживети само ферментацију (низак ниво РОС) или дисање (повећани нивои РОС), што олакшава разјашњавање механизама укључених у стицање толеранције на оксидативни стрес. Штавише, базе података квасца су најкомплетније од свих еукариотских модела. У овом раду истичемо вредност од С. церевисиае као модел за истраживање одговора на оксидативни стрес и његовог потенцијалног утицаја на старење и болести повезане са старењем.


Увод

Стабилност крајева хромозома у ћелијама квасца одржава се комплексом ДНК-протеин специфичним за теломере (Лидалл, 2003). Кључна компонента ове капе теломера је једноланчани ДНК-везујући протеин, Цдц13п (Нугент ет ал., 1996). У а цдц13-1 мутант инкубиран на недовољној температури, неотворене теломере се препознају као двоструки прекиди, што доводи до акумулације једноланчане ДНК на крајевима хромозома (Гарвик ет ал., 1995. Марингеле и Лидалл, 2002.), изазивајући контролну тачку оштећења ДНК сигнал (Гарвик ет ал., 1995) и промовишући заустављање терминалног ћелијског циклуса на Г2/М (Веинерт и Хартвелл, 1993). Када се ове ћелије врате на дозвољену температуру након дужег задржавања, само мали део се опоравља. Ова ћелијска смрт се приписује губитку есенцијалних гена лоцираних у субтеломерним регионима (Гарвик ет ал., 1995. Боотх ет ал., 2001.), конверзији једноланчане ДНК на теломерима у непоправљене смртоносне лезије (Јиа ет ал., 2004. ), и/или формирање хромозомских фузија од краја до краја (ДуБоис ет ал., 2002).

Недавно су Ки ет ал. (2003) су показали да умирање цдц13-1 ћелије показују фенотипске маркере апоптозе као што је излагање фосфатидилсерину на спољашњем слоју плазма мембране, акумулација реактивних врста кисеоника (РОС) и индукција активности каспазе заснована на задржавању инхибитора каспазе ФИТЦ-ВАД-ФМК. Везивање секвенце валил-аланил-аспартил (ВАД) за активирану каспазу сисара омогућава групи флуорометил кетона (ФМК) да реагује са цистеином на активном месту, што резултира инактивацијом и флуоресцентним обележавањем протеина (Грабарек и Дарзинкиевицз, Дарзинкиевицз). Квасац изражава једну протеазу сличну каспази, Ица1п. Попут каспаза сисара, Ица1п се подвргава цепљењу, што активира његову протеолитичку активност према неколико синтетичких супстрата каспазе ин витро (Мадео ет ал., 2002а). Ица1п активност може инхибирати З-ВАД-ФМК (Мадео ет ал., 2002а). Неисцепљени ФИТЦ-ВАД-ФМК може се лако испрати из живих ћелија, али мртве ћелије задржавају ФИТЦ и могу се детектовати зеленом флуоресценцијом у проточној цитометрији. Дакле, ин виво обележавање квасца са ФИТЦ-ВАД-ФМК се приписује бона фиде активацији каспазе (Мадео ет ал., 2002а Ки ет ал., 2003. Херкер ет ал., 2004. Вадског ет ал., 2004.). Брисање МЕЦ1, хомолог АТМ/АТР киназе квасца, спречио је ово цдц13-1 апоптоза, што сугерише да незаштићене теломере стварају а МЕЦ1-зависни апоптотички сигнал смрти (Ки ет ал., 2003).

У овом извештају показујемо да ћелијска смрт изазвана инактивацијом Цдц13п не зависи од протеазе сличне каспази Ица1 или повећане производње РОС. Даље показујемо да је проточна цитометрија мерења активности каспазе и производње РОС, коришћењем инхибитора каспазе коњугованих са флуорохромом и дихидрородамина 123 (ДХР123), респективно, збуњујућа везивањем за већ мртве ћелије квасца. Овај рад сугерише да је проточна цитометријска анализа умирућих ћелија квасца подложна значајним артефактима и указује на потребу да се реинтерпретирају претходни резултати о механизмима смрти ћелија квасца.


МАТЕРИЈАЛИ И МЕТОДЕ

Сојеви и медији квасца

Сој квасца дивљег типа (4741) и мутант за изогену репликацију ДНК (4741дна2-1) (Куо и Кембел, 1983) коришћени су за све експерименте. Течни ИПД медијум (2% глукозе, 1% екстракт квасца, 2% пептон) је коришћен за узгој ћелија квасца на 24&#к000б0Ц, дозвољеној температури раста за дна2-1 напрезати се.

Изолација младих и старих ћелија елутриацијом

За изолацију младих и старих ћелија, в ВТ4741 сој и изогени сој који садржи дна2-1 мутација, 4741дна2-1, су разблажени на одговарајући начин и узгајани на 24°Ц у два литра ИПД који садржи 35 ±003 бцг/мл хлорамфеникола. ћелије дивљег типа, ВТ4741, први пут су узгајани током &#к0223ц10 генерација (А600 = 10). Затим су 3 &#к000д7 10 8 10-генерацијски старе ћелије изоловане елутриацијом и затим инокулиране у два литра свеже ИПД медијума и поново узгајане током &#к0223ц8 генерација (А600 = 1.5). И младе (1 до 3 генерације) и старе ћелије (16-18 генерација) изоловане су другом елутриацијом, дајући 2 &#к000д7 10 9 младих ћелија и 4,8 &#к000д7 10 8 старих ћелија. Ћелије су брзо замрзнуте у течном азоту и чуване на -80&#к000б0Ц. Имајте на уму да екстракције РНК нису обављене на ћелијама дивљег типа старе 1 до 3 генерације и 10 генерација које су сакупљене у А600 = 10. Последња култура ћелија дивљег типа је узгајана до тако велике густине да се избегне три елутриације за сваку културу, чиме се минимизира време припреме. Младе ћелије дивљег типа и ћелије дивљег типа старе 18 генерација које се користе за екстракцију РНК сакупљене су знатно испод границе дијауксија на основу густине културе у време сакупљања (&#к0003ц3.2) (ДеРиси ет ал., 1997 ).

За изолацију младих и старих дна2-1 мутантне ћелије, 5 &#к000д7 10 8 4741дна2-1 ћелије које расту експоненцијално су инокулисане у два литра ИПД који садржи 35 &#к003бцг/мл хлорамфеникола и узгајане за &#к0223ц8 генерације на 24&#к000б0Ц (А600 = 1,5-2). Млади и стари 4741дна2-1 ћелије су одвојене испирањем. Сакупили смо 1,2 &#к000д7 10 9 ћелија старих од 1 до 3 генерације, а принос ћелија старих 8 генерација био је 3,6 &#к000д7 10 8 . Опет, водило се рачуна о жетви много пре дијауксичке смене. Узорци испраних младих и старих ћелија су брзо замрзнути у течном азоту и чувани на -80&#к000б0Ц.

Комплетан опис технике елутриације може се наћи у (Диамонд, 1991). Укратко, пелете ћелија сакупљене из експоненцијално растућих култура су испране у физиолошком раствору пуферованом фосфатом (ПБС 136,89 мМ НаЦл, 2,68 мМ КЦл, 5,37 мМ На2ХПО4, 1,76 мМ КХ2ПО4, пХ 7,4), а ћелије су ресуспендоване у 20 мл ПБС-а и говеђег серумског албумина (2 мг/мл). Групе ћелија су раздвојене звучним зрачењем (30 с), а ћелијска суспензија је филтрирана мрежицом (3-64/32 НИТЕКС Тетко, Бриарцлифф Манор, Н.И.). Комора за елутриацију је затим напуњена са 20 мл ћелијске суспензије која одговара &#к0223ц3 &#к000д7 10 11 ћелија (2 литра културе, А600 = 10, прво испирање) за ВТ4741 и &#к0223ц7 &#к000д7 10 10 ћелија за 4741 дна2-1 (2 литра културе, А600 = 2). Млади дивљи тип и дна2-1 ћелије су изоловане фиксирањем брзине протока воде убризгане у центрифугу на 45 мл/мин и брзине ротора центрифуге на 1400 рпм. Стари дивљи тип и дна2-1 ћелије су елутрисане фиксирањем брзине протока на 85 мл/мин и брзине ротора, респективно, на 900 о/мин и 1550 о/мин (Ј-6М центрифуга са ЈЕ-10 &#к000д7 ротором Бецкман Цоултер, Фуллертон, ЦА). Припрема ћелија пре убацивања у елутриатор трајала је &#к0223ц1 х. Једном напуњене, младе ћелије су изоловане у року од 30 минута на 24&#к000б0Ц, а затим постављене на 4&#к000б0Ц. Било је потребно &#к0223ц3 х да се изолују фракције старих ћелија. Што се тиче младих ћелија, извршили смо елутриацију старих ћелија на 24&#к000б0Ц, а ћелије су затим постављене на 4&#к000б0Ц. Проточна цитометријска анализа је открила да је дистрибуција ћелијског циклуса била иста за елутрисане и нелутриране ћелије.

Цалцофлуор Бојење

Обојили смо испране младе и старе ћелије флуоресцентним избељивачем (Цалцофлуор Вхите М2Р Тинопал УНПА-ГКС #Ф3543) да бисмо избројали ожиљке од пупољака и утврдили старост ћелија изолованих испирањем. Око 10 6 ћелија је једном испрано у 150 к003бцл 1М сорбитола и ресуспендовано у 150 к003бцл флуоресцентног избељивача (10 мг/мл) током 5 минута на 4°к000б0Ц. Након што су четири пута испране са свежим 1 М сорбитолом, ћелије су ресуспендоване у 20 &#к003бцл 1 М сорбитола и затим посматране под флуоресцентним аксиоскопом (Царл Зеисс, Јена, Немачка).

Индиректна имунофлуоресценција

Нуклеоли су праћени индиректном имунофлуоресценцијом коришћењем моноклонских антитела усмерених против богатог нуклеоларног протеина Ноп1 (Арис и Блобел, 1988 Маис Хоопес ет ал., 2002). После 1 сата инкубације са пуфером са калијум фосфатом (КПО4), магнезијум хлорид (МгЦл2) и 37% формалдехида, ћелије су стављене у 2 М сорбитол пуфер и третиране зимолиазом (0,3 мг/мл Зимолиасе 20Т, 0,1% &#к003б2-меркаптоетанола) на 30°Ц током 45 минута током ВТ4741 процедити и 15 мин за 4741дна2-1 напрезати се. Ћелије су затим фиксиране на плочице обложене тефлоном са осам јажица претходно третиране са 0,1% полилизина 6040805 ИЦН Биомедицалс, Коста Меса, Калифорнија). После 15 минута у раствору за блокирање (ПБС, 0,5% говеђег серумског албумина, 0,5% пилећег албумина, 0,5% Твеен 20), ћелије су инкубиране са примарним антителима разблаженим на 1:2000 у блок раствору 2 х на собној температури. Ћелије су затим испране четири пута у пуферу за блокирање и инкубиране 2 х са секундарним антителом, зечјим анти-мишјем разблаженим у 1:5000 у раствору за блокирање. После инкубације, ћелије су испране четири пута у раствору за блокирање и одмах обојене са 4&#к02032,6&#к02032-диамидино-2-фенилиндолом (ДАПИ). ДАПИ је коришћен при 50 нг/мл као што је претходно описано (Маис Хоопес ет ал., 2002). Ћелије су затим посматране под флуоресцентним аксиоскопом (Царл Зеисс) у комбинацији са Орца 2 камером (Хамаматсу, Бридгеватер, Њ).

Проточна цитометрија

За анализу проточне цитометрије, узорци су фиксирани у 70% етанолу. После дигестије преко ноћи са РНазом И (8 мг/мл у ПБС) на 37&#к000б0Ц и 4-часовне дигестије са протеиназом К (1 мг/мл) на 50&#к000б0Ц, ћелије су ресуспендоване у пропидијум јодиду у ПБС (50 & #к003бцг/мл), соникирано (излаз 3-20% радног циклуса, 15 с) и филтрирано са мрежицом (3-64/32 НИТЕКС Тетко). Контролни сој (ВТ4741) је узгајан асинхроно на 24&#к000б0Ц (са &#к0223ц52% ћелија контролног соја са 1Ц и 48% са садржајем 2Ц) и до засићења да би се идентификовао 1Ц пик (100% има садржај 1Ц).

Експерименти и анализа ДНК микромрежа

Старе и младе ћелије дивљег типа су изоловане као што је описано под &#к0201цИзолација младих и старих ћелија испирањем.&#к0201д Очишћене ћелије из шест таквих експеримената (укупно 12 литара), дајући 4,8 &#к000д7 10 8 ћелија свака , су обједињени. Узорци ових ћелија су коришћени за вишеструке екстракције РНК (види доле). Стар и млад дна2-1 ћелије су изоловане као што је описано под &#к0201цИзоловање младих и старих ћелија елутриацијом.&#к0201д Елутрисане ћелије из осам таквих експеримената (укупно 16 литара), дајући по 3,6 &#к000д7 10 8 ћелија, су обједињене. Узорци ових ћелија су коришћени за вишеструке екстракције РНК (види доле).

РНК екстракције су изведене са врућим/фенол хлороформом, а затим Рнеаси колоном (74104 КИАГЕН, Валенсија, Калифорнија). цДНК је синтетизована коришћењем олиго(дТ) прајмера (18418-012 Инвитроген, Царлсбад, ЦА) и Поверсцрипт реверзне транскриптазе (8460-1 БД Биосциенцес Цлонтецх, Пало Алто, ЦА) коришћењем 60 &#к003бцг укупне РНК за сваку реакцију. цДНК је означена током реверзне транскрипције или са Ци5-обележеним дЦТП-ом (црвено, ПА55021 Амерсхам Биосциенцес, Писцатаваи, Њ), или са Ци3-обележеним дЦТП-ом (зелено, ПА53021 Амерсхам, Биосциенцес), према упутствима добављача (Цлонтецх Биосциенцес ). За сваки препарат цДНК коришћени су независни РНК препарати.

Нивои РНК у младим и старим ћелијама одређивани су у дупликату за сваки сој рациометријском методом коришћењем анализе хибридизације микромрежа. Извели смо два контролна експеримента (један за дивљи тип и један за дна2-1), који се састојао од одређивања нивоа РНК у младим ћелијама истог соја, алтернативно обележених са Ци3 и Ци5. Такође смо извршили четири експеримента хибридизације који су се састојали од поређења нивоа РНК у младим ћелијама и старим ћелијама истог соја. За сваки сој, дивљи тип и дна2-1, обављена су два експеримента хибридизације. У првом експерименту, Ци3 је коришћен за припрему цДНК из младих ћелија и Ци5 за старе ћелије. У другом експерименту, боје су замењене да би се уклонила било каква пристрасност која је можда била уведена ген-специфичним разликама у инкорпорацији две боје. На пример, једнаке количине Ци3 и Ци5 обележених боја, причвршћених за њихове одговарајуће цДНК, коришћене су за сваки низ (најмање 20 пмол). Поред тога, као што је управо поменуто, коришћене су независне РНК изолације за сваки препарат цДНК да би се контролисале могуће разлике услед екстракцијских поступака. Хибридизације су изведене на ДНК микромрежама компаније Цорнинг Мицроарраис Тецхнологи (Фоунтаин Валлеи, ЦА). ЦМТ Иеаст-С228ц Гене Арраи верзија 1.31 садржи &#к0003е6160 производе ланчане реакције полимеразе (ПЦР) (&#к0223ц1 кб) који представљају отворене оквире читања (ОРФ) из потпуно секвенционираних С. церевисиае геном, плус 108 контролних гена из Бациллус субтилис. За хибридизацију, микронизови су инкубирани у 50 &#к003бцл хибридизационог раствора (1% сонициране сперме лососа, 24,75% формамида, 4,95&#к000д7 ССЦ, 0,099% СДС, и 0,99 мМретол 020202020) . После прања (1 мин у 2&#к000д7 ССЦ, 0,1% СДС на 42&#к000б0Ц 5 мин у новом раствору 2&#к000д7 ССЦ, 0,1% СДС на 42&#к000б0Ц 10 мин у 0,1&#к000б000 0,1&#к000б000. с, 2 мин, 2 мин и 1 мин у 0.1&#к000д7 ССЦ 15 с у 0.01&#к000д7 ССЦ), одвојене слике су добијене за сваку боју, а односи интензитета флуоресценције су добијени за све гене (Генепик-Про3.0 Аксон скенер 4000А).

Анализу смо извршили користећи МАРраи, софтвер који омогућава кориснику да анализира појединачне или упарене скупове података микромрежа (Ванг ет ал., 2002). МАРраи дефинише квалитет експеримената са микромрежама и процењује поновљивост експеримената реплицирања. Анализа се састојала од три корака: филтрирања, нормализације и интерпретације. Током филтрирања, уклоњена су сва празна или негативно означена места (коефицијент заставице је дат у Генепик фајлу) (погледајте додатне податке хттп://волдлаб.цалтецх.еду/

лесур/олд_анд_иоунг_целлс/МАрраи_оутпут.пдф). Елиминисали смо гене који нису показивали конзистентан профил експресије у дупликатима (на пример, гени који су били више експримирани у младим ћелијама дивљег типа у првом експерименту, али су затим били више експримирани у старим ћелијама дивљег типа у поновљени експеримент). После свега филтрирања, 5733 гена дивљег типа и 6141 дна2-1 гени су остали. Минимални интензитет сигнала сваке тачке је постављен на нулу. Користили смо два контролна експеримента да квантификујемо буку због саме технике, посебно пристрасност боје, и да поставимо прагове за идентификацију гена који су значајно различито изражени у старим или младим ћелијама у сваком соју. Ово поставља границе интензитета за тумачење експерименталних низова. Затим смо нормализовали интензитет младе/старе ћелије користећи нормализацију односа зависну од интензитета како је то описао Јанг ет ал. (2002). Подаци су представљени као позадински одузети, нормализовани односи младих/старих за сваки низ. За сваки сој, пријављени односи експресије су просек два односа експресије младе ћелије/старе ћелије након нормализације две хибридизације у којима су Ци3 и Ци5 флуоресцентне боје обрнуте (погледајте табеле у додатним подацима). Да бисмо демонстрирали поновљивост хибридизација, израчунали смо коефицијенте корелације за сваки скуп обрнутих експеримената.

Цео експеримент је такође изведен поново упоређујући младе ћелије изоловане без елутриације са старим ћелијама изолованим елутриацијом. Активирани гени су пали на исте путеве идентификоване у пријављеним подацима. Резултати нису укључени јер младе ћелије нису изоловане испирањем као што су биле у скупу података који је овде представљен, што чини усредњавање података немогућим. Међутим, важно је напоменути да се резултати значајно преклапају и доводе до идентичних тумачења.

База података о протеомима квасца (хттп://ввв.инците.цом/протеоме/маинмену.јпс), база података генома Саццхаромицес (хттп://геноме-ввв.станфорд.еду/Саццхаромицес) и напомене МИПС Цомпрехенсиве Иеаст За интерпретацију профила експресије коришћена је база података генома (хттп://мипс.гсф.де/прој/иеаст/ЦИГД/дб/индек.хтмл). Поред тога, поређење наших резултата са недавно генерисаним базама података које описују транскрипциону реакцију квасца на различите стресове околине, услове који продужавају животни век и на различите мутације које доводе до оштећења или поправке хромозома било је драгоцено (Јелински и Самсон, 1999 Гасцх ет ал., 2000 , 2001 Јелински ет ал., 2000 Реп ет ал., 2000 Каеберлеин ет ал., 2002 Лин ет ал., 2001 Лин ет ал., 2002 ).

Квантитативна реверзна транскрипција у реалном времену РТ-ПЦР

Потврда диференцијално експримираних транскрипата је извршена коришћењем иЦицлер ИК ПЦР система за детекцију у реалном времену (Био-Рад, Херцулес, ЦА) на цДНК добијеној из старих и младих ћелија изолованих системом за елутриацију. Укупна РНК је добијена из сваког узорка и третирана деоксирибонуклеазом (каталошки број 1906 Амбион, Аустин, ТКС) да би се уклонила контаминација ДНК. цДНК је синтетизована коришћењем 5 &#к003бцг РНК и иСцрипт комплета за синтезу цДНК из Био-Рад (каталошки бр. 170-8891).

Четири микролитра серијског десетоструког разблажења (10, 100, 1.000 и 10.000) цДНК добијене реверзном транскрипцијом су амплификована у 25-&#к003бцл реакционој мешавини која садржи 1&#к000д7 СИБР Греен Супермик (каталошки бр.88). Био-Рад) и 25 пМ сваког прајмера. Сваки узорак је рађен у три примерка. После 3 мин Так корак активације на 95&#к000б0Ц, реакције су подвргнуте 50 циклуса денатурације од 10 с на 95&#к000б0Ц и 10-с екстензије на 54&#к000б0Ц. Прајмери ​​су купљени од ИДТ Интегратед Тецхнологиес (Цоравилле, ИА). Парови прајмера су изабрани да се минимизира димеризација прајмера и да се генерише ампликон између 100 и 150 парова база. Оптички подаци су прикупљени током корака жарења сваког циклуса. После ПЦР-а, реакциони производи су топљени 1 мин на 95°Ц, а затим је температура подешена на 54°Ц и повећана на 94°Ц у корацима од 0,5°Ц. Оптички подаци су прикупљени током трајања повећања температуре. Ово је урађено како би се осигурало да је само један ПЦР производ амплификован по реакцији.

Релативна експресија РТ-ПЦР производа је одређена коришћењем математичког модела М.В. Пфаффла (Пфаффл, 2001). Овај модел израчунава релативни израз коришћењем односа једначине = [(Ециљ) &#к00394Цт циљ(контрола - узорак) ]/[(Ереф) &#к00394Цт реф(контрола - узорак)]. Однос циљног гена је изражен у узорку у односу на контролу у поређењу са референтним геном. Ециљ је ефикасност ПЦР-а у реалном времену транскрипта циљног гена, Ереф је ПЦР ефикасност у реалном времену референтног генског транскрипта, &#к00394Цтциљ је Цт девијација контроле - узорак транскрипта циљног гена, и &#к00394Цтреф = Цт девијација контроле - узорак референтног транскрипта гена. Референтни ген који смо користили је ТУБ1 јер је то стабилан нерегулисани транскрипт у сваком од наших скупова података микромрежа. Проучавано је девет циљних гена који припадају рекомбинационом путу у дивљем типу и дна2-1 сојева. За израчунавање односа старе ћелије/младе ћелије, појединачна ПЦР ефикасност у реалном времену (Е) и одступање &#к00394Цт морају бити познати. Израчунали смо ефикасност према Е = 10 [-1/нагиб] . Пошто је сваки узорак рађен у три примерка, средња вредност Цт је коришћена у једначини, а вредности &#к00394Цт су биле разлике у просечним вредностима Цт између старих и младих ћелија за исти ген. Контролни узорак који садржи исту концентрацију цДНК је одабран да се упореди са циљним геном.


РЕЗУЛТАТИ

Индукција смрти водоник-пероксидом, сирћетном киселином и хиперосмотским шоком

Изабрали смо водоник пероксид и сирћетну киселину за индукцију ПЦД и ТУНЕЛ-позитивног фенотипа у С. церевисиае, да се одреди природа лезија ДНК откривених ТУНЕЛ тестом. Смрт ћелија налик апоптози изазвана ова два једињења је опсежно окарактерисана у неколико лабораторија (Мадео ет ал., 1999, 2002 Лудовико ет ал., 2001а, 2002 Фабрицио ет ал., 2004 Виссинг ет ал., 2004 Гианнаттасио ет ал., 2005). Хиперосмотски шок од 60% (вт/вт) глукозе је недавно описан и да индукује ТУНЕЛ-позитиван фенотип као и друге апоптотичке маркере (Силва ет ал., 2005). Ћелије су узгајане у преткултури преко ноћи, а затим две генерације у свежем медијуму пре третмана водоник пероксидом, сирћетном киселином или 60% (теж./теж.) глукозе, као што је описано у Материјали и методе. Узорци су узети у нултом времену иу различитим временским тачкама, као што је приказано на Слици 1. Ћелије су распоређене на чврсти ИПД медијум и јединице које формирају колоније (ц.ф.у.) су пребројане након 3 дана инкубације. Проценат преживљавања је израчунат као број ц.ф.у. добијено у свакој временској тачки подељено бројем ц.ф.у. добијено у време 0. Третман са 10 мМ водоник пероксида је иницирао ћелијску смрт (Слика 1А) без лаг фазе. Ћелијска смрт од 175 мМ сирћетне киселине при пХ 3,0 показала је почетну фазу кашњења од ~30 мин, пре него што је смрт ћелије била очигледна (Слика 1Б). Третман од 200 минута са 175 мМ сирћетне киселине при пХ 3,0 или 10 мМ водоник пероксида или 60% (тежина/теж) глукозе током 10 х (слика 1Ц) резултирао је ∼10% преживљавања, што је према нашем и туђем искуству (Мадео ет ал., 1999) даје највећи принос ТУНЕЛ-позитивних ћелија. Третман од 20-25 минута са 150 мМ водоник пероксида (слика 1Д) дао је отприлике исти преостали преживљавање као 10 мМ током 200 минута, што представља индукцију ћелијске смрти приближно 10 пута бржу.

Слика 1. С. церевисиае БИ4741 је инкубиран са 10 мМ водоник пероксида (А) или 175 мМ сирћетне киселине, пХ 3,0 (Б), 60% (теж./теж) глукозе (Ц) или 150 мМ водоник пероксида (Д). Узорци су узети у назначеним временским тачкама и постављени на чврсти ИПД медијум. ц.ф.у. су избројани након 2 дана инкубације на 30°Ц. Релативни опстанак је уцртан на Икс-axis (100% corresponds to the number of c.f.u. at time 0). Values are mean ± SEM of three independent experiments.

TUNEL Stains Both SSBs and DSBs in S. cerevisiae

Cells grown as described in Материјали и методе were fixed with formaldehyde and subsequently digested with Zymolyase to remove the cell wall. Cells were treated with DNaseI to generate chromosomal DSBs. DNaseI cleaves both DNA strands at approximately the same site, producing DNA fragments with blunt ends or to a lesser extent protruding termini of one or two nucleotides. The cells were then stained with TUNEL protocol according to previously published protocols (Madeo ет ал., 1997). The nuclei was intensely stained by TUNEL in cells treated with DNaseI (Figure 2, DNaseI) This staining does not occur in nontreated cells (Figure 2, negative control). Positive TUNEL staining was also obtained by treatment with N.BbvCIA nicking endonuclease (Figure 2, N.BbvCIA). N.BbvCIA is a restriction enzyme engineered to cut one DNA strand only. This result shows that the free 3′-OH exposed in SSBs in С. церевисиае is a good substrate for the terminal transferase in the TUNEL reaction. Cells treated with hydrogen peroxide or acetic acid (as described in Материјали и методе), but no added restriction enzymes, did also show TUNEL staining (Figure 2, hydrogen peroxide and acetic acid). TUNEL staining is more diffuse and has slightly higher background for the hydrogen peroxide-treated cells. Nevertheless, nuclei are clearly visible against the background.

Figure 2. Bright field and epifluorescence images of TUNEL and in situ ligation-stained cells. Left column, TUNEL staining of exponentially growing cells, fixed and treated with DNaseI or N.BbvCIA nicking endonuclease. Right column, in situ ligation staining of exponentially growing cells, fixed and treated with BsuRI (blunt endonuclease) or DNaseI and N.BbvCIA (nicking endonuclease). Row marked negative control shows exponentially growing cells stained with TUNEL or in situ ligation staining. Rows marked hydrogen peroxide and acetic acid show cells incubated for 200 min with 10 mM hydrogen peroxide or 175 mM acetic acid, pH 3.0. Left, phase-contrast microscopy right, fluorescence microscopy of the same cells. Bar, 5 μm.

ISL Assay Specifically Stains DSBs in S. cerevisiae

Cells were also subjected to ISL staining with a fluorescent double-stranded DNA hairpin probe according to the methods published by Didenko and coworkers (Didenko and Hornsby, 1996 Didenko ет ал., 1999). A small double strand fluorescent DNA probe is ligated to sites of DSBs. It has been shown to specifically stain mammalian apoptotic cells (Didenko ет ал., 2003). The probe cannot ligate to single-stranded DNA breaks and is therefore in theory more specific for DSBs than TUNEL staining. Specific ISL staining, visually similar to staining by TUNEL, was evident in cells treated with DNaseI and the blunt restriction enzyme BsuRI (Figure 2, in situ ligation, DNaseI and BsuRI). There was no detectable staining in the absence of endonucleases (Figure 2, in situ ligation, negative control). ISL does not stain cells treated with nicking endonuclease N.BbvCIA, confirming that SSBs do not facilitate ligation of the ISL probe (Figure 2, N.BbvCIA). These results show that both TUNEL and ISL procedures are equally efficient at detecting DSBs in С. церевисиае chromosomal DNA, but TUNEL assay also detects nicked DNA. Cells treated with peroxide or acetic acid did not show any ISL staining (Figure 2, hydrogen peroxide and acetic acid), indicating that these cells do not contain blunt DSBs.

Staggered DSBs Can Be Discriminated by ISL in Combination with Klenow DNA Polymerase

ISL has been used to distinguish between different types of staggered DSBs in combination with Klenow DNA polymerase (Didenko ет ал., 2003). Theoretically, if DSBs with 5′ overhangs are present, the DNA polymerase activity of Klenow will synthesize the missing DNA in the presence of dNTPs and produce blunt ends. In contrast, if DSBs breaks with 3′ overhangs are present, the Klenow 5′-3′ exonuclease activity will degrade the overhang until the DNA is blunt.

To test whether ISL could discriminate between different types of DSBs in С. церевисиае, we performed ISL on cells treated with endonucleases producing 5′ or 3′ overhang. Cells were grown, fixed, and Zymolyase treated, as described above, and subsequently treated with restriction endonucleases, creating either 1-base pair 3′ overhangs (HhaI) or 1-base pair 5′ overhangs (Bme1390I). None of the enzyme-treated samples showed any positive staining with ISL assay (Figure 3, − Klenow). This shows that ISL does not stain staggered DSBs. ISL staining is restored to cells treated with HhaI and to cells treated with Bme1390I, by treatment with Klenow DNA polymerase and Klenow DNA polymerase plus dTNPs, respectively (Figure 3, + Klenow). This means that different types of staggered double-stranded DNA ends can be discriminated by the ISL assay in yeast. The intensity is lower than for the DNaseI or BsuRI treatment (Figure 2), probably due to incomplete transformation of staggered DSBs.

Figure 3. Bright field and epifluorescence images of in situ ligation-stained cells. Exponentially growing cells were treated with HhaI (1-base pair 3′ overhang) and Bme1390I (1-base pair 5′ overhang) endonucleases. The cells in the right column were treated with Klenow (+ Klenow, HhaI) or Klenow + dNTPs (+ Klenow, Bme1390I) before in situ ligation staining. Left, phase-contrast microscopy right, fluorescence microscopy of the same cells. Bar, 5 μm.

We reasoned that the lack of ISL staining of cells treated with hydrogen peroxide or acetic acid (Figure 2, hydrogen peroxide, acetic acid) may be that they contain staggered DSBs that are not detectable by ISL. We added Klenow or Klenow and dNTPs to cells treated with hydrogen peroxide or acetic acid in a manner similar to the experiment described in Figure 3, but the ISL staining was still negative (Figure 4). This indicates that hydrogen peroxide- or acetic acid-treated cells do not contain staggered DSBs with 1-base pair overhangs.

Figure 4. Bright field and epifluorescence images of in situ ligation-stained cells. In situ ligation staining of cells incubated for 200 min with 10 mM hydrogen peroxide or 175 mM acetic acid, pH 3.0. The cells were treated with Klenow (left column) or Klenow + dNTPs (right column) before in situ ligation staining. Left, phase-contrast microscopy right, fluorescence microscopy of the same cells, Bar, 5 μm.

Chromosomal DNA Is Damaged in Cells Treated with Hydrogen Peroxide, Acetic Acid, or High Concentrations of Glucose

In our hands, ISL assay together with Klenow or Klenow + dNTPs is limited in the overhang length of staggered DSBs that the method can overcome. We treated cells with enzymes creating four-base pair overhangs with subsequent Klenow transformation to blunt DSBs, and we noted a considerable decrease in the ISL signal (our unpublished data) compared with the treatments with HhaI and Bme1390I (Figure 3). This led to the hypothesis that cells treated with hydrogen peroxide or acetic acid may have staggered DSBs with long overhangs, undetectable by ISL.

To overcome this difficulty, we analyzed chromosomal DNA from cells treated with hydrogen peroxide, acetic acid, or glucose-induced hyperosmotic shock using PFGE (Figure 5A). Samples were taken at six time points between zero and 200 min (hydrogen peroxide, acetic acid) or 10 h (hyperosmotic shock). DNA from cells treated with hydrogen peroxide after 200 min (Figure 5A, hydrogen peroxide, lane 200 min) was completely degraded to a smear of fragments slightly shorter than С. церевисиае chromosome I (225 kb) but still of a considerable size. The DNA from acetic acid-treated cells showed less degradation but still a visible smear and chromosomal bands of lower intensity (Figure 5A, acetic acid, lanes 60–200 min). DNA from cells killed by hyperosmotic shock showed degradation over 10 h comparable to that of hydrogen peroxide-treated cells (Figure 5A, glucose 60%, lanes 6–10 h). This is the first time that clear DNA degradation has been shown in С. церевисиае associated with PCD.

Figure 5. Genomic DNA analyzed by PFGE from viable cells (A and C–E) or fixed С. церевисиае cells (B). Cells were exposed to 10 mM hydrogen peroxide, 175 mM acetic acid, pH 3.0, 60% (wt/wt) glucose, or 150 mM hydrogen peroxide as indicated in the figure. Lanes marked as control were loaded with DNA isolated from exponentially growing cells without further treatment. Samples were collected after various periods as indicated (minutes) except for treatment with 60% (wt/wt) glucose, where time points are indicated in hours. (D) Cells were exposed to 10 mM hydrogen peroxide or 175 mM acetic acid, pH 3.0, and isolated chromosomal DNA was subsequently treated with S1 nuclease to degrade nicked DNA. Lane marked control S1 is similar to control lanes, but the DNA was treated with S1 nuclease before PFGE. (E) Lanes 1 and 2 show chromosomal DNA from nontreated cells, digested with N.BbvCIA nicking endonuclease (1) or DNaseI (2).

DNA Fragmentation by Hydrogen Peroxide Requires Active Enzymes

Cells were fixed with 3.7% (vol/vol) formaldehyde before treatment with 10 mM hydrogen peroxide for 200 min or 150 mM for 25 min (Figure 5B) to test whether the presence of active enzymes is necessary for DNA fragmentation to proceed. Fixing cells with formaldehyde preserves the structure of cells and enzymes, but it eliminates enzymatic activity. The fixed cells treated with hydrogen peroxide show no DNA damage, indicating that the DNA fragmentation requires some enzymatic activity within the cell and that fragmentation is not due to a direct chemical reaction between hydrogen peroxide and DNA (Figure 5B). In addition, purified yeast chromosomes were not degraded by 10 mM hydrogen peroxide in vitro for 200 min (our unpublished data).

DNA Fragmentation by Hydrogen Peroxide Does Not Occur after Treatment with High Concentrations of Hydrogen Peroxide

A common observation regarding PCD is that specific markers of PCD usually only occur within a rather limited window of treatment intensity. At too high intensity of the treatment, the cell is presumed to die from complete breakdown (necrosis) before any PCD process can be initiated. Chromosomal DNA was fragmented during 200-min treatment with 10 mM hydrogen peroxide (Figure 5A). During this process, the fraction of viable cells decreases from 100 to ∼5–10% (Figure 1A). The DNA in С. церевисиае cells treated with 150 mM hydrogen peroxide remained intact (Figure 5C) for the 25 min necessary for a decrease from 100 to ∼1% surviving cells (Figure 1C). This result shows that cell death is only associated with DNA fragmentation for treatment of relatively low intensity.

DNA Damage in Hydrogen Peroxide- or Acetic Acid-treated Cells Is Primarily Made Up of SSBs

Lack of ISL staining of cells treated with hydrogen peroxide or acetic acid combined with the finding that TUNEL assay is not specific for DSBs led us to the hypothesis that the main type of DNA damage detected by TUNEL in our experiments consists of SSBs. This hypothesis can be tested by treatment of the DNA with S1 nuclease that will preferably attack at sites of single-stranded DNA breaks, reducing SSBs to DSBs, causing the DNA to migrate faster on the gel. Figure 5D shows a PFGE gel with DNA from cells treated with hydrogen peroxide or acetic acid, with and without treatment with S1 nuclease. Untreated DNA (Figure 5D, lane control) shows little degradation with S1 nuclease treatment (Figure 5D, lane control S1), indicating that no or few single-stranded breaks are present in untreated cells. Comparing the same time points for hydrogen peroxide- and acetic acid-treated cells without (Figure 5A) and with S1 treatment (Figure 5D, lanes marked +), there is an enhanced degradation upon S1 treatment. We conclude that the main form of DNA damage in hydrogen peroxide- and acetic acid-treated cells consists of single-stranded DNA breaks.

N.BbvCIA Nicking Endonuclease and Hydrogen Peroxide Treatment Yield Similar DNA Damage

It is evident from the images showing DNA damage (Figure 5A) that although the chromosomes are broken down to the point of not being visible, the resulting fragments are still several hundreds of kilobases and do not seem to break down into smaller fragments. We treated isolated DNA with DNaseI and N.BbvCIA nicking endonuclease (Figure 5E). Isolated DNA treated with DNaseI broke down into fragments too small to be visible on the gel (Figure 5E, lane 2), whereas DNA treated with N.BbvCIA (Figure 5E, lane 1) revealed DNA fragmentation with the same visual appearance on the gel as cells treated with hydrogen peroxide for 200 min (Figure 5A, lane 200 min). This observation is consistent with the conclusion that DNA damage in hydrogen peroxide-treated cells are primarily a consequence of accumulation of SSBs.


Boy Is Clue to What Causes Aging

One of Niederhofer's colleagues on the study was Jan Hoeijmakers, PhD, of Erasmus Medical Center in Rotterdam, Netherlands.

Hoeijmakers had heard from doctors in Germany about a 15-year-old Afghan boy with an extreme form of premature aging, a condition called progeria.

Настављено

The boy was extremely sensitive to sunlight and had had an old, wizened appearance since age 10.

He was gaunt, had hearing loss and vision problems, and had had hepatitis A and tuberculosis as a young child.

The boy died when he was 16 after getting severe pneumonia and having organ failure. Genetic tests showed the boy had a severe mutation in his XPF gene, a gene involved in DNA repair.


Фусноте

Изјава издавача: Ово је ПДФ датотека неуређиваног рукописа који је прихваћен за објављивање. Као услугу нашим клијентима, пружамо ову рану верзију рукописа. Рукопис ће бити подвргнут копирању, монтажи и прегледу резултирајућег доказа пре него што буде објављен у коначном облику за цитирање. Имајте на уму да током процеса производње могу бити откривене грешке које би могле утицати на садржај, а односе се и сва правна одрицања одговорности која се односе на часопис.


Deleting 'Anti-Aging' Gene From Yeast Greatly Lengthens Life Span

A counterintuitive experiment has resulted in one of the longest recorded life-span extensions in any organism and opened a new door for anti-aging research in humans.

Scientists have known for several years that an extra copy of the SIR2 gene can promote longevity in yeast, worms and fruit flies.

That finding was covered widely and incorporated into anti-aging drug development programs at several biotechnology companies.

Now, molecular geneticists at the University of Southern California suggest that SIR2 instead promotes aging.

Their study, "Sir2 Blocks Extreme Life-Span Extension," appears in the Nov. 18 edition of the biology journal Cell. The lead author is Valter Longo, assistant professor in the Leonard Davis School of Gerontology and the USC College of Letters, Arts and Sciences.

Rather than adding copies of SIR2 to yeast, Longo's research group deleted the gene altogether.

The result was a dramatically extended life span - up to six times longer than normal - when the SIR2 deletion was combined with caloric restriction and/or a mutation in one or two genes, RAS2 and SCH9, that control the storage of nutrients and resistance to cell damage.

Human cells with reduced SIR2 activity also appear to confirm that SIR2 has a pro-aging effect, Longo said, although those results are not included in the Cell paper.

Since all mammals share key aging-related genes, the paper points to a new direction for human anti-aging research.

Longo proposes that SIR2 and possibly its counterpart in mammals, SIRT1, may block the organism from entering an extreme survival mode characterized by the absence of reproduction, improved DNA repair and increased protection against cell damage. Organisms usually enter this mode in response to starvation.

The long-lived organisms in Longo's experiment showed extraordinary resilience under stress.

"We hit them with oxidants, we hit them with heat," Longo said. "They are highly resistant to everything. What they're doing is basically saying, 'I cannot afford to age. I still have to generate offspring, but I don't have enough food to do it now."

Longo predicted that as molecular geneticists master the levers of aging, they will be able to design drugs that coax the body into entering chosen aspects of a starvation-response mode, such as stress resistance, even when food is plentiful.

If enough food is available, an organism might be programmed both to reproduce normally and to maximize its survival systems.

Longo urged caution in extrapolating the result to humans.

"We have been very successful with simple organisms," he said. "Naturally, mammals are complex, and it will be a great challenge to get major life-span extension."

A "really exciting" implication, Longo said, is that cells may be able to speed up their DNA repair efforts. All organisms have the ability to repair harmful mutations in their DNA, whether caused by age, radiation, diet or other environmental factors. Cancer often begins when DNA mutations outstrip a cell's ability to remain differentiated.

Many researchers believe DNA repair systems are already running flat out. The organisms in Longo's experiment say otherwise.

"In our paper, we show that age-dependent mutations increase at a much slower pace in organisms lacking RAS2 or SCH9 and at a remarkably low pace in organisms lacking both SCH9 and SIR2, raising the possibility that the mutations that cause human cancers can be delayed or prevented," Longo said.

"Notably, mutations that increase the activity of human homologs of the yeast SCH9 and RAS2 genes play central roles in many human cancers." Homologs are genes descended from a common ancestral DNA sequence.

Joining with researchers at the USC Norris Comprehensive Cancer Center, Longo is studying the feasibility of reducing or preventing the age-dependent DNA mutations that cause cancer.

Longo and his collaborators began studying SIR2 in 2000, soon after a well-known set of experiments by Leonard Guarente at the Massachusetts Institute of Technology. Guarente was the first to show that over-expression of the SIR2 gene could extend life span beyond its natural limit.

However, Longo said, "We were convinced that SIR2 had the potential to be a more potent pro-aging than an anti-aging gene. And the reason was in part because of the similarity with this other gene, called HST1, which negatively regulated so-called protective genes. So we set out to test whether SIR2 could do the opposite of what everybody said it does."

The researchers do not quarrel with Guarente's finding of a moderate increase in life span when SIR2 is over-expressed. But their work shows that much greater potential gains lie in the opposite direction.

Longo's co-author was USC research scientist Paola Fabrizio. The other USC authors were Cristina Gattazzo, Luisa Battistella, Min Wei, Chao Cheng and Kristen McGrew.

Funding for this research came from the American Federation for Aging Research and from the National Institute of Aging of the National Institutes of Health.


The type of vacuole found in yeast cells is somewhat analogous to the lysosome that we animals possess in that it is involved in breaking down waste products and recycling broken cellular components (via the process of autophagy) that would otherwise harm the cell. It is an agent of cellular housekeeping, in other words. There the similarities end, however, as the vacuole performs many other vital tasks that the more specialized lysosome does not.

So here, researchers show that they can extend life in yeast by reversing a change that occurs in the vacuole. Because the vacuole has many more tasks than the lysosome, it's not immediately clear that this has any application to our biology of aging, however. It is still worth keeping an eye on this research as we know that decline in lysosomal function (and thus of cellular housekeeping) is important in animal aging. You might recall, for example, that researchers managed to reverse the age-related loss of liver function in mice by finding a way to keep lysosomal function running at youthful rates. Similarly, reversing the root causes of lysosomal decline is on the SENS agenda - to be achieved by breaking down the build up of metabolic waste products that accumulate in lysosomes and cause them to malfunction.

Normally, mitochondria [in yeast] are beautiful, long tubes, but as cells get older, the mitochondria become fragmented and chunky. The changes in shape seen in aging yeast cells are also observed in certain human cells, such as neurons and pancreatic cells, and those changes have been associated with a number of age-related diseases in humans.

The vacuole - and its counterpart in humans and other organisms, the lysosome - has two main jobs: degrading proteins and storing molecular building blocks for the cell. To perform those jobs, the interior of the vacuole must be highly acidic. [Researchers] found that the vacuole becomes less acidic relatively early in the yeast cell's lifespan and, critically, that the drop in acidity hinders the vacuole's ability to store certain nutrients. This, in turn, disrupts the mitochondria's energy source, causing them to break down. Conversely, when [researchers] prevented the drop in vacuolar acidity, the mitochondria's function and shape were preserved and the yeast cells lived longer.

Until now, the vacuole's role in breaking down proteins was thought to be of primary importance. We were surprised to learn it was the storage function, not protein degradation, that appears to cause mitochondrial dysfunction in aging yeast cells. . The unexpected discovery prompted [the researchers] to investigate the effects of calorie restriction, which is known to extend the lifespan of yeast, worms, flies and mammals, on vacuolar acidity. They found that calorie restriction - that is, limiting the raw material cells need - delays aging at least in part by boosting the acidity of the vacuole.


Variations

  • Use the procedure above to make plates with diluted yeast cultures and expose the yeast to sunlight at various times of day for example, at 10:00 AM, noon, and 2:00 PM. Use the same duration of exposure.
  • Expose the yeast for various durations at the same time of day, for example 0, 0.5, 1, 2, 4, and 8 minutes at noon.
  • Compare wild-type and DNA-repair-deficient yeast strains for UV sensitivity. Obtain wild-type С. церевисиае from a science supply company for example, Carolina Biological, item # 898900. Culture this strain and plate out dilutions, as described in the procedure. Compare the sensitivity of the wild-type and DNA-repair-deficient strains to ultraviolet light from the sun.


Погледајте видео: ДНК (Август 2022).